Escherichia Coli O157 : Kit de détection d'acide nucléique H7 (méthode de sonde fluorescente PCR/lyophilisation)
Description du kit :
Chat non.FP103
Il est utilisé pour la détection et le dépistage rapides d'E. coli O157:H7 dans les denrées alimentaires, les aliments pour animaux, les échantillons d'eau et les échantillons environnementaux.
Descriptions
Il est utilisé pourdétection et dépistage rapides d'E. coli O157:H7 dans les denrées alimentaires, les aliments pour animaux, les échantillons d'eau et les échantillons environnementaux.
[Principe de test]
Selon le principe de la technologie PCR fluorescente, des amorces spécifiques et des sondes Taqman sont conçues pour le gène spécifique d'Escherichia coli O157 : H7, et détectées par un instrument PCR fluorescent, de manière à réaliser la détection d'Escherichia coli O157 : H7 Détection qualitative de l'ADN.
Contenu du kit
Remarque : la sonde de canal ROX n'est pas incluse.
| Ccomposants | spécification | Qquantité |
| Tampon A | Tube | 1 |
| Tampon B | Tube | 1 |
| Contrôle positif | Tube | 1 |
| Contrôle négatif | Tube | 1 |
Utilisation prévue
Il est utilisé pour détection et dépistage rapides d'E. coli O157:H7 dans les denrées alimentaires, les aliments pour animaux, les échantillons d'eau et les échantillons environnementaux.
Conditions de stockage et date d'expiration
Conserver à -20℃ dans l'obscurité et éviter la congélation et la décongélation répétées.
La période de validité est de 12mois et la date de production est indiquée sur l'emballage extérieur.
Instruments et consommables
Instrument de PCR quantitatif fluorescent, pistolet à pipette et embouts assortis, agitateur vortex, mini centrifugeuse.
Usage
1. Traitement des échantillons
1.1 Type d'échantillon : Ce kit convient aux échantillons de denrées alimentaires, d'aliments pour animaux, d'eau et d'autres échantillons suspectés d'être contaminés par Escherichia coli O157:H7.Pour les produits carnés transformés en profondeur, les boissons et autres substances contenant des pigments, ils doivent être rincés pour éviter d'affecter la collecte du signal de fluorescence.
1.2 Traitement des échantillons : reportez-vous à "GB 4789.10-2016 Food Safety National Standard Food Microbiological Examination of Escherichia coli O157 : H7 Test" pour la préparation des échantillons, la culture d'enrichissement et l'isolement d'Escherichia coli O157 : H7.
- Nextraction d'acide nucléique
Prendre 20 mL de solution d'enrichissement dans un tube à centrifuger de 1,5 mL, ajouter 200 μL de lysat microbien (un kit supplémentaire est nécessaire), vortexer pendant 30 secondes, centrifuger brièvement et mettre de côté.
Remarques : L'extraction de l'acide nucléique du lysat doit être terminée en 10 minutes et ne peut pas être conservée pendant une longue période.
3. Amplification des acides nucléiques
3.1 Allumez l'instrument de PCR quantitatif fluorescent pour l'utiliser.
Tampon A et tampon B du kit , faites-les fondre soigneusement et centrifugez brièvement.Ajouter 18 μL de tampon A et 2 μL de tampon B dans chaque tube de réaction PCR.Ajouter ensuite 5 ml de contrôle négatif, d'acide nucléique extrait et de contrôle positif dans des tubes de réaction PCR, boucher les tubes et centrifuger brièvement.
3.3 Transférez le tube de réaction PCR dans une machine PCR fluorescente et utilisez les procédures suivantes pour effectuer des expériences d'amplification : sélectionnez 25 mL pour le système de réaction, collectez les signaux de fluorescence à 60 °C pour chaque cycle et sélectionnez FAM pour le canal de détection.
| Marcher | Programme | Nombre de cycles |
| 1 | 37℃ 5min | 1 |
| 2 | 9 5 ℃ 3min | 1 |
| 3 | 95°C 15s | 4 0 |
| 60℃ 30s (recueillir la fluorescence) |
Guides pour l'analyse des problèmes
The following is an analysis of the problems that might be encountered in the extraction of viral RNA. We wish it would be helpful to your experiment. In addition, for other experimental or technical problems other than operating instructions and problem analysis, we have dedicated technical support to help you. Contact us if you need at : 028-83361257or E-mail：Tech@foregene.com。
Aucun ARN ne peut être extrait ou le rendement en acide nucléique est faible
De nombreux facteurs affectent généralement l'efficacité de la récupération, tels que : la teneur en ARN de l'échantillon, la méthode de fonctionnement, le volume d'élution, etc.。
Analyse des causes communes：
1. Bain de glace ou centrifugation à basse température (4 ° C) pendant le fonctionnement.
Suggestion : Fonctionnement à température ambiante (15-25 °C), jamais de bain de glace et de centrifugeuse à basse température.
2. Stockage d'échantillons incorrect ou stockage d'échantillons trop long.
Suggestion : Conserver les échantillons à -80 °C ou les congeler dans de l'azote liquide, et éviter les utilisations répétées de congélation-décongélation ;essayez d'utiliser des échantillons fraîchement prélevés pour l'extraction d'ARN.
3.Lyse d'échantillon insuffisante
Recommandation : Veuillez vous assurer que l'échantillon et la solution de travail (Linear Acrylamide) ont été soigneusement mélangés et incubés pendant 10 min à température ambiante (15-25 ° C)
4. L'éluant n'a pas été ajouté correctement
Recommandation : Assurez-vous que ddH2O sans RNase est ajouté au milieu de la membrane de la colonne de purification
5.Improper volume d'éthanol anhydre dans le tampon viRW2
Suggestion : veuillez suivre les instructions, ajouter le volume correct d'éthanol anhydre au tampon viRW2 et bien mélanger avant d'utiliser le kit.
6. Utilisation inappropriée de l'échantillon.
Suggestion : 200 µl d'échantillon pour 500 µl de tampon viRL.Un volume d'échantillon excessif entraînera une réduction du taux d'extraction d'ARN.
7. Volume d'élution incorrect ou élution incomplète.
Suggestion : Le volume d'éluant de la colonne de purification est de 30 à 50 μl ;si l'effet d'élution n'est pas satisfaisant, il est recommandé d'ajouter du ddH sans RNase préchauffé2O et prolonger le temps de mise à température ambiante, par exemple 5-10min
8. La colonne de purification contient des résidus d'éthanol après rinçage dans le tampon viRW2.
Suggestion : S'il reste encore de l'éthanol après le rinçage dans le tampon viRW2 et la centrifugation du tube vide pendant 2 min, la colonne de purification peut être laissée à température ambiante pendant 5 min après la centrifugation du tube vide pour éliminer complètement l'éthanol restant.
La dégradation des molécules d'ARN purifiées
La qualité de l'ARN purifié est liée à des facteurs tels que le stockage des échantillons, la contamination par la RNase et le fonctionnement.
Analyse des causes communes：
1.Les échantillons collectés n'ont pas été enregistrés à temps.
Suggestion : Si l'échantillon n'est pas utilisé à temps après le prélèvement, veuillez le stocker immédiatement à -80 ℃ ou à l'azote liquide.Pour l'extraction des molécules d'ARN, essayez d'utiliser autant que possible des échantillons fraîchement prélevés.
2. Les échantillons collectés gelaient et dégelaient à plusieurs reprises.
Suggestion : Éviter la congélation et la décongélation répétées (pas plus d'une fois) pendant le prélèvement et le stockage des échantillons, sinon le rendement en acide nucléique diminuera.
3. La RNase a été introduite dans la salle d'opération ou aucun gant, masque, etc. jetable n'a été porté.
Suggestion : L'expérience d'extraction des molécules d'ARN est mieux réalisée dans une salle d'opération d'ARN séparée, et la table expérimentale est nettoyée avant l'expérience.Portez des gants et des masques jetables pendant l'expérience pour éviter la dégradation de l'ARN causée par l'introduction de la RNase.
4. Le réactif est contaminé par la RNase lors de l'utilisation.
Suggestion : remplacer par le nouveau kit d'isolement d'ARN viral pour les expériences associées.
5. La contamination par la RNase des tubes à centrifuger, des embouts de pipette, etc. Suggestion : assurez-vous que les tubes à centrifuger, les embouts de pipette et les pipettes sont tous exempts de RNase.
Les molécules d'ARN purifiées ont affecté les expériences en aval
Les molécules d'ARN purifiées par la colonne de purification affecteront les expériences en aval s'il y a trop d'ions de sel ou de protéines, telles que : transcription inverse, Northern Blot, etc.。
1.Il reste des ions de sel dans les molécules d'ARN éluées.
Recommandation : assurez-vous que le volume correct d'éthanol anhydre a été ajouté au tampon viRW2 et lavez la colonne de purification deux fois en fonction de la vitesse de centrifugation correcte indiquée dans le mode d'emploi ; s'il reste encore des ions de sel, vous pouvez ajouter le tampon viRW2 à la colonne de purification et le laisser à température ambiante pendant 5 min.Effectuez ensuite une centrifugation pour éliminer au maximum la contamination par les ions de sel
2. Il reste de l'éthanol dans les molécules d'ARN éluées
Suggestion : après avoir confirmé que les colonnes de purification ont été rincées par le tampon viRW2, effectuez une centrifugation à tube vide conformément à la vitesse de centrifugation indiquée dans le mode d'emploi.S'il reste encore de l'éthanol, on peut le laisser 5 minutes à température ambiante après une centrifugation à tube vide pour éliminer au maximum l'éthanol restant.
Manuels d'utilisation:
Manuel d'instructions du kit d'isolement de l'ARN viral
