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Descriptions

Ce kit utilise un système de tampon de lyse unique qui peut rapidement libérer l'ARN des échantillons de cellules cultivées pour les réactions RT-qPCR, éliminant ainsi le processus de purification de l'ARN, long et laborieux.La matrice d'ARN peut être obtenue en seulement 7 minutes.Les réactifs 5×Direct RT Mix et 2×Direct qPCR Mix-SYBR fournis par le kit permettent d'obtenir rapidement et efficacement des résultats PCR quantitatifs en temps réel.

5 × Direct RT Mix et 2 × Direct qPCR Mix-SYBR ont une forte tolérance aux inhibiteurs, et le lysat des échantillons peut être utilisé directement comme modèle pour la RT-qPCR.Ce kit contient la transcriptase inverse Foregene unique à haute affinité et l'ADN polymérase Hot D-Taq, les dNTP, le MgCl₂, tampon de réaction, optimiseur et stabilisateur PCR.

Caractéristiques

200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns

Composants du kit

Fonctionnalités et avantages

■ Simple et efficace : avec la technologie Cell Direct RT, les échantillons d'ARN peuvent être obtenus en seulement 7 minutes.

■ La demande d'échantillon est faible, aussi peu que 10 cellules peuvent être testées.

■ Haut débit : il peut détecter rapidement l'ARN dans les cellules cultivées dans des plaques 384, 96, 24, 12, 6 puits.

■ DNA Eraser peut supprimer rapidement les génomes libérés, réduire considérablement l'impact sur les résultats expérimentaux ultérieurs.

■ Le système RT et qPCR optimisé rend la transcription inverse RT-PCR en deux étapes plus efficace et la PCR plus spécifique et plus résistante aux inhibiteurs de la réaction RT-qPCR.

Demande de kit

Champ d'application : cellules cultivées.

- ARN libéré par lyse d'échantillon : uniquement applicable à la matrice RT-qPCR de ce kit.

- Le kit peut être utilisé aux fins suivantes : analyse de l'expression génique, vérification de l'effet de silençage génique médié par l'ARNsi, criblage de médicaments, etc.

Diagramme

Stockage et durée de conservation

La partie I de ce kit doit être stockée à 4℃ ;La partie II doit être stockée à -20℃.

Foregene Protease Plus II doit être stocké à 4℃, ne pas congeler à -20℃.

Le réactif 2×Direct qPCR Mix-SYBR doit être stocké à -20℃ dans l'obscurité ;s'il est utilisé fréquemment, il peut également être stocké à 4 ℃ pour un stockage à court terme (utilisation dans les 10 jours). Nous avons été un fabricant expérimenté.Gagner la majorité dans les certifications cruciales de son marché pour le kit Rt-Qpcr V2 de sonde en une étape à haute sensibilité en Chine, la qualité est la vie de l'usine, l'accent sur la demande des clients est la source de la survie et du développement de l'entreprise, nous adhérons à l'honnêteté et à l'attitude de travail de bonne foi, dans l'attente de votre venue!
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QuickEfacileTM Cell Direct RT-qPCR Kit -Taqman

Cat.No.DRT-01021/01022

Pour la RT-qPCR directe cellulaire utilisant ≤ 1 000 000 cellules

Présentation du produit

Ce produit utilise un système de tampon de lyse unique pour libérer rapidement l'ARN des échantillons de cellules cultivées pour les réactions RT-qPCR, éliminant le processus de purification d'ARN long et laborieux, et seulement 7 minutes pour obtenir la matrice d'ARN requise, avec le 5 × Direct RT Mix, 2 × Direct qPCR Mix-Taqman fourni par le kit peut obtenir rapidement et efficacement des résultats de PCR quantitatifs en temps réel.

5× Direct RT Mix et 2× Direct qPCR Mix-Taqman ont une forte tolérance aux inhibiteurs et peuvent effectuer une inversion efficace et une amplification spécifique en utilisant le lysat de l'échantillon à mesurer comme modèle.Le réactif contient Foregene Reverse Transcriptase, Hot D-Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl₂, tampon de réaction, optimiseur et stabilisateur PCR, qui peut être utilisé avec un tampon de lyse pour détecter rapidement et facilement des échantillons, et présente les caractéristiques d'une sensibilité, d'une spécificité et d'une stabilité élevées.

Caractéristiques du produit

Technologie Cell Direct RT simple et efficace qui prend aussi peu que 7 minutes pour obtenir des échantillons d'ARN.

Les besoins en échantillons sont faibles et un minimum de 10 cellules cultivées peut être utilisé pour l'expérimentation.

Haut débit pour l'acquisition rapide d'ARN de cellules cultivées telles que les plaques 384, 96, 24, 12 et 6 puits.

DNA Eraser est capable de supprimer rapidement les génomes libérés, réduisant considérablement l'impact sur les résultats expérimentaux ultérieurs.

Les systèmes RT et qPCR optimisés permettent une RT-PCR en deux étapes avec une transcription inverse plus efficace, une spécificité et une tolérance aux inhibiteurs de la réaction RT-qPCR plus forte.

Demande de kit

Champ d'application : Cellules cultivées.

ARN interprété par lyse d'échantillon : utilisé uniquement comme modèle de RT-qPCR en deux étapes.

Les kits peuvent être utilisés aux fins suivantes : analyse de l'expression régulatrice des gènes, test d'allèles, dépistage de médicaments, etc.

Limites du kit

Fragments amplifiés ≤ 300 pb.

Les kits sont utilisés pour les cellules fraîchement cultivées.

Contrôle de la qualité des produits

Selon le système de gestion de la qualité totale de FOREGENE, chaque lot de kits de la série Cell Direct RT-qPCR est rigoureusement testé plusieurs fois pour garantir la fiabilité et la stabilité de la qualité de chaque lot de kits.

Contenu du kit

*:Cell Lysis, 5 × Direct RT Mix, 2 × Direct qPCR Mix-Taqman peuvent être achetés séparément, les détails sont fournis dans l'annexe 1 (PAGE 13).

Conditions de stockage

1. Conditions d'expédition

L'ensemble du processus de transport de la boîte de glace à basse température, pour s'assurer que le kit est à l'état <4 °C.

2. Conditions de stockage

Conserver la partie I à 4°C et la partie II à -20°C.

Le Foregene Protease Plus II doit être conservé à 4 °C et non congelé à -20 °C.

Le réactif 2× Direct qPCR Mix-Taqman est conservé à -20 °C, ou à 4 °C pour une utilisation à court terme s'il est utilisé fréquemment (dans les 10 jours).

Informations sur les composants du kit

Tampon CL : Fournit l'environnement requis pour les réactions de lyse cellulaire.

Tampon ST : termine la substance active dans le lysat pour éviter les effets sur la RT ultérieure.

DNA Eraser : ADN remover, l'effet de la suppression du génome sur les expériences ultérieures.

5× Direct RT Mix : Contient une haute affinité pour l'ARN Foregene Reverse Transcriptase, un inhibiteur de RNase, des dNTP, des stabilisants, des activateurs, des optimiseurs et des amorces de transcription inverse pour un alignement optimal (Random Primer, Oligo(dT)₁₈Apprêt).

Foregene Protease Plus II : Dans le contexte du tampon de lyse, les cellules sont lysées pour libérer les acides nucléiques.

2× Direct qPCR Mix-Taqman : ce réactif contient de l'ADN polymérase D-Taq chaude, des dNTP, du MgCl₂, tampon de réaction, optimiseur PCR et stabilisateur.

Colorant de référence ROX 20× : généralement utilisé sur les instruments d'amplification PCR en temps réel d'ABI, Stratagene et d'autres sociétés, il est utilisé pour ajuster la différence entre les tubes PCR et les tubes causés par des erreurs de dosage PCR.La concentration de colorant de référence 20 × ROX requise pour différents instruments est différente et l'utilisateur peut l'ajouter en fonction de la concentration recommandée de l'instrument.

ddH sans RNase₂O : eau ultra pure stérilisée sans RNase pour les réactions de RT-qPCR en deux étapes.

Précautions:(Assurez-vous de lire attentivement les précautions avant d'utiliser le kit)

Faites attention à la méthode de fonctionnement de l'expérience pour éviter la contamination croisée entre les échantillons.

Faites attention à la propreté de l'environnement expérimental et des ustensiles pour éviter la contamination par la RNase et la dégradation de l'ARN.

Prélevez des échantillons de cellules fraîches ou bien conservées et n'utilisez jamais d'échantillons de cellules congelées et décongelées répétées.

5 × Direct qPCR Mix, 2 × Direct qPCR Mix-Taqman doit éviter les congélations-décongélation répétées, sinon cela affectera la transcription inverse et l'efficacité de la PCR.

Préparationsavantopération

Assurez-vous de lire attentivement les instructions avant d'utiliser ce kit.Le kit Cell Direct RT-qPCR est simple, pratique et rapide à utiliser, et les instructions fournissent des informations complètes sur l'ensemble du kit et comment l'utiliser correctement.Veuillez préparer le matériel et l'équipement expérimentaux nécessaires avant utilisation.

Matériels et équipements expérimentaux

◆ Culture de cellules.

◆ 1,5 ml ou 2 ml, tube à centrifuger sans RNase/DNase, pointe sans RNase/DNase, tube qPCR stérile de 0,2 ml.

◆ Appareil qPCR, pipette, centrifugeuse de table (≥13 400×g) (selon les besoins expérimentaux), etc.

Sécurité

◆ Ce produit est uniquement destiné à la recherche scientifique, veuillez ne pas l'utiliser à des fins pharmaceutiques, cliniques, alimentaires et cosmétiques.

◆ Lors de l'utilisation de produits chimiques, portez des vêtements de laboratoire appropriés, des gants, des lunettes de protection, etc.

Opérationguider

Les systèmes de lyse cellulaire, les systèmes RT et les packs de suppléments de solution de réaction qPCR peuvent être achetés séparément, pour plus de détails à l'annexe 1 (PAGE 13).

Guide d'opération

A : Échantillon de libération d'ARN

1.Les cellules ont été prétraitées : laver la plaque de culture cellulaire avec du PBS froid, puis lyser les cellules (10-10⁶), dix⁶ que la quantité de cellules, il est recommandé Foregene the Cell an RNA Isolation Kit the Total (DE-03111) ou Animal Total RNA Isolation Kit (DE-03011) pour l'extraction et la purification de l'ARN.

1.1.Cellules adhérentes (plaque 24 puits par exemple)

1.1.1.Déterminez le nombre de cellules dans chaque puits, déterminez que le nombre de cellules est de 1 × 10⁵, et utilisez une pipette pour retirer le milieu de culture de la boîte de culture.

1.1.2.Ajouter 200 μl de 1 × PBS pré-réfrigéré dans chaque puits.Ne pas pipeter à plusieurs reprises et retirer le PBS des puits.Inclinez la plaque et retirez autant de PBS que possible.Passez à l'étape 2.

1.1.3.Une boîte de culture cellulaire différente ou un tableau de numéros de référence 1-1 dans une boîte de culture cellulaire a été ajouté prérefroidi 1 × PBS pour le lavage des cellules.

Tableau 1-1 : Dosage de PBS pour différents nombres de cellules

Note：Pour assurer une ferme adhérence des cellules，un grand nombre de pertes de cellules évitées lors du lavage.

1.2.Cellules en suspension ou cellules adhérentes cultivées dans des plaques non poreuses

1.2.1.Les cellules adhérentes cultivées dans des plaques non multi-puits (les cellules en suspension commencent à partir de l'étape suivante 1.2.2), collectent et séparent les cellules selon la méthode normale de collecte de cellules et placez-les dans une plaque de culture ou un tube à centrifuger ;si la trypsinisation est utilisée, nécessite une centrifugation pour collecter les cellules et pour éliminer la trypsine résiduelle, a ajouté des cellules remises en suspension dans du PBS dans des cellules individuelles pour disperser les cellules.

1.2.2.Après le nombre de cellules comptées, aliquoter les cellules 1×10⁵ un pour centrifuger les tubes, recueillir les cellules par centrifugation à 1000 × g pendant 10 min.

1.2.3.Ajouter 200 ul de PBS dans le tube à centrifuger, ne pas pipeter à plusieurs reprises et aspirer directement le PBS.passez à l'étape 2. (Si difficile à précipiter et que les cellules ont été remises en suspension, peut être effectué 1000 × g centrifugé 10 min après avoir jeté le surnageant, le culot cellulaire passer à l'étape 2)

2.Lyse cellulaire : retirez le tampon CL, sa température équilibrée à la température ambiante, l'effaceur d'ADN et la protéase Foregene Plus II, conformément au tableau 1-2 suivant du système de lyse préparé : (la solution de lyse est prête à l'emploi).

Tableau1-2 : clivage préparation du système (Remarque : dans la préparation sur glace)

3. (Plaque de 24 puits à titre d'exemple) Pipettez 200 μl de mélange maître de lyse cellulaire dans chaque puits, soufflez à plusieurs reprises 5 à 10 fois, incubez à température ambiante (20-25 ℃) pendant 5 min.

Note：Pour éviter la formation de bulles, s'il vous plaît lorsque l'échelle de la pipette de pipetage a été ajustée à 200 μl ou moins.Les cellules peuvent apparaître troubles après la lyse, ce qui est normal.

4. (plaque de 24 puits à titre d'exemple) est ajouté dans le liquide 20 μl de tampon ST (différents systèmes de lyse tampon ST ajouté en une quantité indiquée dans le tableau 1-3), pipetage répété 5 à 10 fois, à température ambiante (20-25 ℃) ont été incubés pendant 2 min.

Note：La pointe de la pipette disposée sous la surface, assurant que le lysat a été ajouté，pour éviter la formation de bulles, s'il vous plaît lorsque l'échelle de la pipette de pipetage a été ajustée à 200 μl ou moins.

Tableau 1-3：Ajouter un tampon ST

5.Le lysat est utilisé pour les expériences ultérieures de RT-qPCR.Si les expériences suivantes ne peuvent pas être effectuées à temps, veuillez les conserver sur de la glace pendant 2 heures maximum et les conserver à -20 ℃ ou -80 ℃ (pas plus de trois mois).

B : Préparation du système RT

1. Sortez 5 × Direct RT Mix et placez-le sur un bain de glace, laissez-le fondre naturellement et mélangez-le doucement pour une utilisation ultérieure.sortez ddH2O sans RNase et faites-le fondre et placez-le sur un bain de glace pour une utilisation ultérieure.Préparer le système réactionnel sur glace selon le tableau 2-1 ci-dessous.

Tableau 2-1 : Préparation du système de réaction RT

2.Après l'achèvement de la formulation du système, mélanger doucement et brièvement centrifugé dans le tableau suivant 2 -2 conditions de réaction RT réaction.

Tableau 2-2 : Réglage de la condition de réaction RT

3.Après l'achèvement de la réaction, le produit de la réaction a été placé directement sur de la glace pour qPCR, veuillez mettre la conservation à long terme -20℃ ou -80℃.

Remarque : En raison de l'utilisation d'un modèle non purifié, des précipités blancs peuvent apparaître dans le produit de transcription inverse.C'est un phénomène normal.Centrifuger le surnageant immédiatement pour les expériences ultérieures.

La solution de réaction RT résultante est ajoutée aux systèmes de réaction PCR en temps réel de l'étape suivante, il est recommandé d'ajouter des quantités allant de 10 à 30 % du système de réaction.

C : préparation du système de réaction qPCR

1.Quantité appropriée de B préparée à l'étape matrice d'ADNc selon le tableau 3-1 suivant pour préparer un système de réaction.

Remarque : La quantité de modèle d'ADNc représente 10 à 30 % du système qPCR.Par exemple, dans un système qPCR de 20 μl, ajoutez 2 à 6 μl de tampon de lyse, mais pas plus de 6 μl.

2. L'optimisation des bonnes conditions qPCR (température de recuit, etc.) pour la réaction qPCR (les conditions de réaction indiquées dans le tableau 3-2).

Remarque : essayez d'utiliser des conditions optimisées pour les réactions qPCR afin d'obtenir de meilleurs résultats.

Tableau 3-1 : Préparation du système de réaction PCR

1* : la concentration de l'amorce peut être ajustée dans la plage de 50 à 900 nM lorsque les performances de la réaction de l'amorce sont médiocres.

Remarque : Le système qPCR peut être ajusté en fonction des besoins expérimentaux et du modèle de cycleur de fluorescence.Pour la qPCR dans un 50μl système, ajuster le dosage du réactif proportionnellement selon les 20μle système.

2* : Sélectionnez la concentration finale appropriée de ROX Reference Dye en fonction du cycleur thermique quantitatif de fluorescence.Les concentrations de colorant de référence ROX les plus appropriées pour les cycleurs quantitatifs de fluorescence courants sont indiquées dans le tableau ci-dessous :

Tableau 3-2 : Les conditions de réaction qPCR sont fournies

Remarque : Afin d'obtenir le meilleur effet qPCR, la PCR en gradient peut être utilisée pour optimiser les conditions de réaction pour différentes matrices et différentes amorces.Les conditions de réaction PCR varient en fonction de l'analyseur de fluorescence, du modèle, de l'amorce, etc. Dans l'opération spécifique, les conditions de réaction optimales doivent être conçues en fonction des conditions spécifiques du cycleur thermique quantitatif de fluorescence, du type de modèle, de la taille du fragment d'intérêt, de la séquence de bases du fragment amplifié et du contenu GC et de la longueur des amorces, y compris la température de recuit, le temps de réaction, etc.

Principes de conception des amorces PCR en temps réel

Amorce directe et amorce inverse

Pour la PCR en temps réel, la conception des amorces est très importante.Les amorces sont liées à la spécificité et à l'efficacité de l'amplification PCR et peuvent être conçues en référence aux principes suivants :

◆ Longueur de l'amorce : 18-30 pb.

◆ Teneur en GC : 40-60 %.

◆ Valeur Tm : Un logiciel de conception d'amorce, tel que Primer 5, peut donner la valeur Tm de l'amorce.Les valeurs Tm des amorces en amont et en aval doivent être aussi proches que possible.La formule de calcul de Tm peut également être utilisée : Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).Lors de l'exécution de la PCR, une température inférieure à la valeur Tm de l'amorce de 5 ° C est généralement sélectionnée comme température d'annelage (l'augmentation correspondante de la température d'annelage peut augmenter la spécificité de la réaction PCR).

◆ Amorces et produits PCR :

◆ La longueur du produit d'amplification PCR de l'amorce de conception est de préférence de 100 à 150 pb.

◆ Les amorces de conception dans la zone structurelle secondaire du gabarit doivent être évitées autant que possible.

◆ Éviter la formation de 2 bases complémentaires ou plus entre les extrémités 3′ des amorces amont et aval.

◆ L'embase terminale Primer 3′ ne peut pas être présente avec 3 G ou C consécutifs supplémentaires.

◆ Les amorces elles-mêmes ne peuvent pas avoir de structures complémentaires, sinon une structure en épingle à cheveux se formera, affectant l'amplification par PCR.

◆ ATCG doit être réparti aussi uniformément que possible dans la séquence d'amorces, et la base terminale 3′ doit être évitée comme T.

annexe1：Cell DirectRT-qPCR Composant du kitt supplément pack

1. Solution de lyse cellulaire