Stérilisation des pointes de pipettes et des tubes EP, etc.
1. Préparez 0,1 % (un millième) de DEPC (substance hautement toxique) avec de l'eau déionisée, utilisez-le avec précaution sous une hotte aspirante et conservez-le à 4 °C à l'abri de la lumière ;
L'eau DEPC est de l'eau pure traitée au DEPC et stérilisée par haute température et haute pression.Testé pour être exempt de RNase, DNase et protéinase.
2. Placez la pointe de la pipette et le tube EP dans du DEPC à 0,1 % et assurez-vous que la pointe de la pipette et le tube EP sont remplis de DEP à 0,1 %.
3. Protéger de la lumière, laisser reposer toute la nuit (12-24h)
4. La boîte contenant l'embout et le tube EP n'a pas besoin d'être trempée dans du DEPC.Après avoir retiré grossièrement l'eau DEPC dans la pointe ou le tube EP, emballez-la et emballez-la.
5. 121 degrés Celsius, 30 minutes
6. 180 degrés Celsius, sécher pendant plusieurs heures (au moins 3 heures)
Pas de thé.Portez des gants et des masques en latex lors de la manipulation du DEPC !b, ou sans stérilisation DEPC, 130 ℃, autoclave de 90 min (de nombreux laboratoires stérilisent à haute température deux fois)
Considérations sur l'extraction d'ARN
Deux phénomènes majeurs d'échec de l'isolement de l'ARN tissulaire
Dégradation de l'ARN et résidus d'impuretés dans les tissus,en ce qui concerne la dégradation, examinons d'abord pourquoi l'ARN extrait de cellules cultivées n'est pas facilement dégradé.Les réactifs d'extraction d'ARN existants contiennent tous des composants qui inhibent rapidement la RNase.Ajoutez le lysat aux cellules cultivées et mélangez-le simplement, toutes les cellules peuvent être soigneusement mélangées avec le lysat et les cellules sont complètement lysées.Une fois les cellules lysées, les ingrédients actifs du lysat inhibent immédiatement la RNase intracellulaire, de sorte que l'ARN reste intact.C'est-à-dire que parce que les cellules cultivées sont facilement et entièrement mises en contact avec le lysat, leur ARN n'est pas facilement dégradé ;d'autre part, l'ARN dans le tissu est facilement dégradé car les cellules du tissu ne sont pas faciles à contacter rapidement le lysat.en raison d'un contact suffisant.Donc,en supposant qu'il existe un moyen de transformer le tissu en une seule cellule tout en inhibant l'activité de l'ARN, le problème de la dégradation pourrait être complètement résolu.
Le broyage à l'azote liquide est la méthode la plus efficace.Cependant, la méthode de broyage à l'azote liquide est très gênante, en particulier lorsque le nombre d'échantillons est important.Cela a donné naissance à la meilleure chose suivante : l'homogénéisateur.LehomogénéisateurLa méthode ne tient pas compte de la question de savoir comment l'activité de la RNase est inhibée avant que les cellules ne soient mises en contact avec le lysat, mais prie plutôt que le taux de perturbation des tissus soit plus rapide que le taux auquel la RNase intracellulaire dégrade la RN.
L'effet de l'homogénéisateur électrique est meilleur,et l'effet de l'homogénéisateur de verre est médiocre, mais en général, la méthode d'homogénéisation ne peut pas empêcher le phénomène de dégradation.Par conséquent, si l'extraction est dégradée, l'homogénéisateur électrique d'origine doit être utilisé pour le broyage à l'azote liquide ;l'homogénéisateur en verre d'origine doit être remplacé par un homogénéisateur électrique ou directement broyé avec de l'azote liquide.Le problème est presque réalisable à 100%.être résolu.
Le problème des résidus d'impuretés affectant les expériences ultérieures a des causes plus diverses que la dégradation, et les solutions sont en conséquence différentes.En conclusion,s'il y a dégradation ou impuretés résiduelles dans le tissu, la méthode d'extraction/le réactif pour le matériel expérimental spécifique doit être optimisé.Vous n'avez pas besoin d'utiliser vos précieux échantillons pour l'optimisation : vous pouvez acheter des petits animaux comme du poisson/poulet sur le marché, prendre la partie correspondante du matériel pour l'extraction de l'ARN et l'autre partie pour l'extraction des protéines - broyer avec la bouche, l'estomac et l'extrait d'intestins.
L'ARN cible de l'ARN extrait est utilisé pour différentes expériences de suivi, et ses exigences de qualité sont différentes
La construction de la bibliothèque d'ADNc nécessite l'intégrité de l'ARN sans résidus d'inhibiteurs de réaction enzymatique ;Northern nécessite une intégrité d'ARN plus élevée et des exigences moindres pour les résidus d'inhibiteurs de réaction enzymatique;La RT-PCR ne nécessite pas une intégrité d'ARN trop élevée,mais inhibe les réactions enzymatiques.Les exigences en matière de résidus sont strictes.L'entrée détermine la sortie ;chaque fois que l'objectif est d'obtenir l'ARN de la plus haute pureté, cela coûtera cher aux gens et à l'argent.
Prélèvement/stockage des échantillons
Facteurs affectant la dégradation Après que l'échantillon ait quitté le corps vivant/ou l'environnement de croissance d'origine, les enzymes endogènes de l'échantillon commenceront à dégrader l'ARN,et le taux de dégradation est lié à la teneur en enzymes endogènes et à la température.Traditionnellement, il n'y a que deux façons d'inhiber complètement l'activité enzymatique endogène : ajouter immédiatement le lysat et homogénéiser complètement et rapidement ;couper en petits morceaux et congeler immédiatement dans de l'azote liquide.Les deux approches nécessitent un fonctionnement rapide.Ce dernier convient à tous les échantillons, tandis que le premier ne convient qu'aux tissus à faible teneur en cellules et en enzymes endogènes et plus faciles à homogénéiser.Plus précisément, les tissus végétaux, le foie, le thymus, le pancréas, la rate, le cerveau, la graisse, les tissus musculaires, etc. sont mieux congelés avec de l'azote liquide avant de procéder.
Fragmentation et homogénéisation des échantillons
Facteurs affectant la dégradation et le rendement La fragmentation des échantillons estpour une homogénéisation complète, qui est pour la libération complète et complète de l'ARN.Les cellules peuvent être directement homogénéisées sans être brisées.Les tissus ne peuvent être homogénéisés qu'après avoir été cassés.Les levures et les bactéries doivent être cassées avec les enzymes correspondantes avant de pouvoir être homogénéisées.Les tissus avec une teneur en enzymes endogènes plus faible et une homogénéisation plus facile peuvent être broyés et homogénéisés en une seule fois dans le lysat par un homogénéisateur ;tissu végétal, foie, thymus, pancréas, rate, cerveau, graisse, tissu musculaire et autres échantillons, Ils sont riches en enzymes endogènes ou ne sont pas facilement homogénéisés,la rupture tissulaire et l'homogénéisation doivent donc être effectuées séparément.La méthode de fragmentation la plus fiable et la plus productive est le broyage avec de l'azote liquide, et la méthode d'homogénéisation la plus fiable est l'utilisation d'un homogénéisateur électrique.Remarque spéciale concernant le broyage avec de l'azote liquide : l'échantillon ne doit pas être décongelé pendant tout le processus de broyage, car les enzymes endogènes sont plus susceptibles de fonctionner lorsqu'ils sont congelés.
Choix du lysat
Affectant la commodité de fonctionnement et les facteurs d'impuretés endogènes résiduelles Les solutions de lyse couramment utilisées peuvent presque inhiber l'activité de la RNase.Par conséquent, le point clé du choix d'une solution de lyse est à considérer en combinaison avec la méthode de purification.Il y a une exception :Pour les échantillons à haute teneur en enzymes endogènes, il est recommandé d'utiliser un lysat contenant du phénol pour augmenter la capacité d'inactivation des enzymes endogènes.
Choix de la méthode de purification
Facteurs qui affectent les impuretés endogènes résiduelles, vitesse d'extraction Pour les échantillons propres tels que les cellules, des résultats satisfaisants peuvent être obtenus avec presque toutes les méthodes de purification disponibles.Mais pour de nombreux autres échantillons, en particulier ceux qui contiennent des niveaux élevés d'impuretés comme les plantes, le foie, les bactéries, etc., le choix d'une méthode de purification appropriée est crucial.La méthode de purification centrifuge sur colonne a une vitesse d'extraction rapide et peut éliminer efficacement les impuretés qui affectent la réaction enzymatique ultérieure de l'ARN, mais elle est coûteuse (Foregene peut proposer des kits rentables, plus de détails cliquez surici);l'utilisation de méthodes de purification économiques et classiques, telles que la précipitation au LiCl, permet également d'obtenir des résultats satisfaisants, mais le temps de fonctionnement est long..
"Trois disciplines et huit attentions" pour l'extraction d'ARN
Discipline 1 :Fini la contamination des enzymes exogènes.
Note 1:Portez strictement des masques et des gants.
Note 2:Les tubes à centrifuger, les têtes de pointe, les tiges de pipette, les réservoirs d'électrophorèse et les bancs expérimentaux impliqués dans l'expérience doivent être soigneusement éliminés.
Note 3:Les réactifs/solutions impliqués dans l'expérience, en particulier l'eau, doivent être exempts de RNase.
Discipline 2 :Bloquer l'activité des enzymes endogènes
Remarque 4 :Choisissez une méthode d'homogénéisation appropriée.
Remarque 5 :Choisissez un lysat approprié.
Remarque 6 :Contrôlez la quantité de départ de l'échantillon.
Discipline 3 :Clarifiez votre objectif d'extraction
Remarque 7 :Avec tout système de lysat approchant la quantité de départ maximale d'échantillon, le taux de réussite de l'extraction chute fortement.
Remarque 8 :Le seul critère économique pour une extraction d'ARN réussie est un succès dans les expériences ultérieures, pas le rendement.
Les 10 principales sources de contamination par la RNase
1. Les doigts sont la première source d'enzymes exogènes, c'est pourquoi les gants doivent être portés et remplacés fréquemment.De plus, des masques doivent également être portés, car la respiration est également une source importante d'enzymes.Un avantage supplémentaire du port d'un masque à gants est de protéger l'expérimentateur.
2. Embouts de pipette, tubes à centrifuger, pipettes - La RNase ne peut pas être inactivée par la seule stérilisation, donc les embouts de pipette et les tubes à centrifuger doivent être traités avec du DEPC, même s'ils sont marqués comme traités au DEPC.Il est préférable d'utiliser une pipette à usage spécial, essuyez-la avec un coton à 75% d'alcool avant utilisation, en particulier la tige;de plus, assurez-vous de ne pas utiliser de décapant de tête.
3. L'eau/le tampon doit être exempt de contamination par RNase.
4. Au moins la table de test doit être essuyée avec des boules de coton à 75% d'alcool.
5. RNase endogène Tous les tissus contiennent des enzymes endogènes, donc la congélation rapide des tissus avec de l'azote liquide est le meilleur moyen de réduire la dégradation.La méthode de stockage/broyage de l'azote liquide est en effet peu pratique, mais c'est la seule voie pour les tissus avec des niveaux élevés d'enzymes endogènes.
6. Échantillons d'ARN Les produits d'extraction d'ARN peuvent contenir des traces de contamination par la RNase.
7. Extraction de plasmide L'extraction de plasmide utilise souvent la Rnase pour dégrader l'ARN, et la Rnase résiduelle doit être digérée avec la protéinase K et extraite par PCI.
8. Stockage de l'ARN Même s'il est stocké à basse température, des traces de RNase entraîneront la dégradation de l'ARN.La meilleure solution pour la conservation à long terme de l'ARN est une suspension sel/alcool, car l'alcool inhibe toute activité enzymatique à basse température.
9. Lorsque les cations (Ca, Mg) contiennent ces ions, le chauffage à 80 ° C pendant 5 minutes entraînera le clivage de l'ARN, donc si l'ARN doit être chauffé, la solution de conservation doit contenir un agent chélatant (citrate de sodium 1 mM, pH 6,4).
10. Les enzymes utilisées dans les expériences ultérieures peuvent être contaminées par la RNase.
10 conseils pour l'extraction d'ARN
1 : Empêcher rapidement l'activité de la RNase.Les échantillons sont rapidement congelés après le prélèvement et la RNase est inactivée par une opération rapide pendant la lyse.
2: Choisissez une méthode d'extraction appropriée pour les tissus à haute teneur en ribozyme, et le tissu adipeux est préférable d'utiliser la méthode contenant du phénol.
3 : La qualité de la prédiction nécessite Northern, la construction de la bibliothèque d'ADNc nécessite une intégrité élevée, et la RT-PCR et la RPA (test de protection de la ribonucléase) ne nécessitent pas une intégrité élevée.La RT-PCR nécessite une grande pureté (résidus d'inhibiteurs d'enzymes).
4 : Une homogénéisation approfondie est la clé pour améliorer le rendement et réduire la dégradation.
5 : Vérifiez l'intégrité de la détection par électrophorèse d'ARN, 28S : 18S = 2 : 1 est un signe complet, 1 : 1 est également acceptable pour la plupart des expériences.
6 : Élimination de l'ADN pour RT-PCR, analyse en matrice Il est préférable d'utiliser la Dnase I pour éliminer l'ADN.
7 : Réduire la contamination des enzymes exogènes – les enzymes ne peuvent pas être importées de l'extérieur.
8 : Lors de la concentration d'acide nucléique à faible concentration, un réactif de co-précipitation doit être ajouté.Mais pour empêcher le co-précipitant contenant des enzymes et la contamination de l'ADN.
9 : Dissoudre soigneusement l'ARN, si nécessaire, chauffer à 65°C pendant 5 minutes.
méthode de stockage appropriée
Il peut être stocké à -20C pendant une courte période et à -80C pendant une longue période.La première étape dans l'amélioration des rendements d'ARN est de réaliser que la teneur en ARN des différents échantillons varie considérablement.Abondance élevée (2-4 ug/mg) telle que foie, pancréas, cœur, abondance moyenne (0,05-2 ug/mg) telle que cerveau, embryon, rein, poumon, thymus, ovaire, faible abondance (<0,05 ug/mg) mg) telle que vessie, os, graisse.
1 : Lyser les cellules pour libérer le RN - si l'ARN n'est pas libéré, le rendement sera réduit.L'homogénéisation électrique fonctionne mieux que d'autres méthodes d'homogénéisation, mais peut également devoir être combinée avec d'autres méthodes, telles que le brassage d'azote liquide, la digestion enzymatique (Lysozyme/Lyticase)
2 : Optimisation de la méthode d'extraction.Les plus gros problèmes avec les méthodes à base de phénol sont une stratification incomplète et une perte partielle d'ARN (le surnageant ne peut pas être complètement éliminé).Une stratification incomplète est due à une teneur élevée en acides nucléiques et en protéines, qui peut être résolue en augmentant la quantité de lysat utilisée ou en réduisant la quantité d'échantillon.Une étape d'extraction au chloroforme a été ajoutée au tissu adipeux.La perte d'ARN peut être réduite par rétro-pompage ou en éliminant la couche organique suivie d'une centrifugation.Le plus gros problème avec les méthodes basées sur la centrifugation sur colonne est l'excès d'échantillon.
Conseils d'extraction classiques
1. Purification du phénol : Ajouter un volume égal de 1:1 Phénol/Chloroforme et mélanger vigoureusement pendant 1 à 2 minutes.Centrifuger à grande vitesse pendant 2 minutes.Retirez délicatement le surnageant (80-90%).N'atteignez jamais la couche intermédiaire.Un volume égal de la solution réactionnelle peut être ajouté au Phénol/Chloroforme et le surnageant retiré.Les deux surnageants peuvent être mélangés ensemble pour la précipitation des acides nucléiques afin d'améliorer le rendement.Ne soyez pas trop doux lorsque vous mélangez et n'essayez pas d'enlever tout le surnageant.
2. Lavage avec 70-80% d'éthanol : Pendant le lavage, l'acide nucléique doit être mis en suspension pour s'assurer que le sel résiduel est éliminé.En même temps, immédiatement après avoir versé l'éthanol, centrifuger à grande vitesse pendant quelques secondes, puis éliminer l'éthanol résiduel avec une pipette.Dissoudre après repos à température ambiante pendant 5 à 10 minutes.
11. Extraction d'organisations spéciales
1. Tissu fibreux : La clé de l'extraction d'ARN à partir de tissus fibreux tels que le muscle cardiaque/squelettique est de perturber complètement le tissu.Ces tissus ont une faible densité cellulaire, de sorte que la quantité d'ARN par unité de poids de tissu est faible, et il est préférable d'utiliser autant de quantité de départ que possible.Assurez-vous de broyer soigneusement le tissu dans des conditions de congélation.
2. Tissus à haute teneur en protéines/graisses : la teneur en graisse cérébrale/végétale est élevée.Après extraction PCI, le surnageant contient des flocons blancs.Le surnageant doit être réextrait au chloroforme.
3. Tissus à haute teneur en acide nucléique/ribozyme : la rate/thymus a une haute teneur en acide nucléique et en ribozyme.Le broyage des tissus dans des conditions de congélation suivi d'une homogénéisation rapide peut inactiver efficacement les ribozymes.Cependant, si le lysat est trop visqueux (en raison d'une forte teneur en acides nucléiques), l'extraction PCI ne pourra pas stratifier efficacement ;ajouter plus de lysat peut résoudre ce problème.Plusieurs extractions PCI peuvent éliminer plus d'ADN résiduel.Si un précipité blanc se forme immédiatement après l'ajout d'alcool, cela indique une contamination par l'ADN.La réextraction avec du PCI acide après dissolution peut éliminer la contamination de l'ADN.
4. Tissu végétal : Le tissu végétal est plus complexe que le tissu animal.Généralement, les plantes sont broyées dans des conditions d'azote liquide, de sorte que la dégradation de l'ARN par des enzymes endogènes est rare.Si le problème de dégradation n'est pas résolu, il est presque certainement causé par des impuretés contenues dans l'échantillon.Les impuretés contenues dans de nombreuses plantes conduiront à des résidus, et la raison des résidus est souvent parce que ces impuretés présentent certaines similitudes avec l'ARN : vous précipitez et je précipite, et vous adsorbez et j'adsorbe.Ces caractéristiques déterminent qu'ils sont de très puissants inhibiteurs enzymatiques.
À l'heure actuelle, les réactifs d'extraction d'ARN commerciaux peuvent être adaptés à presque tous les tissus animaux avec de petits ajustements, mais il existe peu de réactifs d'extraction d'ARN commerciaux qui peuvent convenir à la plupart des tissus végétaux.Heureusement, Foregene peut fournir deskits d'extraction d'ARN de plantes, nous avonsKit d'isolement d'ARN total de plantes, Kit d'isolement d'ARN total de plantes Plus.Ce dernier est spécialement conçu pour les plantes à forte teneur en polysaccharides et polyphénols.Pour l'extraction d'ARN, les retours des utilisateurs du laboratoire sont particulièrement bons.
12. L'effet de la congélation et de la décongélation de l'échantillon L'échantillon congelé peut être plus gros et doit être coupé avant d'être utilisé pour l'extraction d'ARN.Les échantillons ont tendance à fondre (éventuellement partiellement) pendant la coupe.Les échantillons congelés peuvent devoir être pesés avant l'extraction de l'ARN, et la décongélation se produira certainement au cours de ce processus.Parfois, la décongélation de l'échantillon se produit également pendant le processus de broyage à l'azote liquide ;soit l'échantillon congelé est directement ajouté au lysat sans broyage à l'azote liquide, et la décongélation aura certainement lieu avant l'homogénéisation complète.Des expériences ont montré que les tissus congelés sont plus sujets à la dégradation de l'ARN lors de la décongélation que les tissus frais.La raison probable : le processus de congélation-décongélation perturbe les structures au sein de la cellule, ce qui facilite le contact direct des enzymes endogènes avec l'ARN.
13. Jugement de la qualité de l'ARN Habituellement, l'électrophorèse est utilisée pour juger de l'intégrité de l'ARN, et A260/A280 est utilisé pour juger de la pureté de l'ARN.En théorie, l'ARN intact a un rapport de 28S:18S = 2,7:1, et la plupart des données soulignent le rapport de 28S:18S = 2:1.Le fait est que presque aucun des ARN extraits d'échantillons autres que des cellules n'est dans un rapport de 2: 1 (ceci a été obtenu à l'aide du bioanalyseur Agilent).
Les résultats d'électrophorèse de l'ARN sont affectés par de nombreux facteurs, notamment la structure secondaire, les conditions d'électrophorèse, la charge de l'échantillon, le degré de saturation par EB, etc. Utilisez l'électrophorèse native pour détecter l'ARN et utilisez le marqueur ADN comme contrôle.Si le 28S à 2kb et le 18S à 0,9kb sont clairs, et 28S : 18S > 1, l'intégrité peut répondre aux exigences de la plupart des expériences ultérieures.
A260/A280 est un indicateur qui a causé beaucoup de confusion.Tout d'abord, il est nécessaire de clarifier la signification originale de cet indicateur pour les acides nucléiques : ARN pur, son A260/280 = environ 2,0.L'ARN pur est la "cause" et A260/A280 = 2 est l'"effet".Maintenant, tout le monde utilise A260/A280 comme « cause », pensant que « si A260/A280 = 2, alors l'ARN est pur », ce qui porte naturellement à confusion.
Si vous êtes intéressé, vous pouvez ajouter un peu de réactif souvent utilisé dans l'extraction, comme le phénol, l'isothiocyanate de guanidine, le PEG, etc., à votre échantillon d'ARN, puis mesurer le rapport A260/A280.La réalité est que de nombreux réactifs utilisés pour l'extraction de l'ARN, ainsi que de nombreuses impuretés dans l'échantillon, absorbent environ A260 et A280, affectant A260/A280.
L'approche la plus instructive à l'heure actuelle consiste à scanner des échantillons d'ARN dans la gamme 200-300 nm.La courbe de l'ARN pur a les caractéristiques suivantes : la courbe est lisse, A230 et A260 sont deux points d'inflexion, A300 est proche de 0, A260/A280 = environ 2,0 et A260/A230 = environ 2,0.Si les données d'analyse ne sont pas disponibles, le rapport A260/A230 doit également être déterminé, car ce rapport est plus sensible au transfert de toutes les impuretés qui affectent la réaction enzymatique.Tenez compte de la plage linéaire de l'appareil (0,1–0,5 pour A260).
Il existe deux autres phénomènes utiles : le rapport sera inférieur d'environ 0,3 lorsque A260/A280 est mesuré dans l'eau ;tandis que le rapport mesuré dans 10 mM d'EDTA est supérieur d'environ 0,2 à celui mesuré dans 1 mM d'EDTA.
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Série d'isolement d'ARN - Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)
Heure de publication : 15 juillet 2022
