L'expérience RT-qPCR comprend l'extraction d'ARN et l'évaluation de la qualité, la transcription inverse et la qPCR en trois étapes, chaque étape comporte de nombreuses précautions, que nous présenterons en détail ci-dessous.

Ⅰ.Évaluation de la qualité de l'ARN

Dans l'expérience RT-qPCR, après l'achèvement de l'extraction de l'ARN, la qualité de l'ARN doit être évaluée et l'expérience de suivi ne peut être effectuée qu'après sa qualification.Les méthodes d'évaluation comprennent le spectrophotomètre, l'électrophorèse sur gel Agilent, l'analyse Agilent 2100, parmi lesquelles le spectrophotomètre le plus couramment utilisé et la détection de la méthode d'électrophorèse sur gel d'agarose.Il convient de noter que ces deux méthodes doivent être utilisées ensemble pour compléter la détection et l'analyse de la concentration, de la pureté et de l'intégrité de l'ARN, afin d'assurer la qualité de l'ARN.

Kit d'isolement d'ARN associé : 

Kit d'isolement d'ARN total cellulaire

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Kit d'isolement d'ARN total animal

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Spectrophotomètre :

Le spectrophotomètre est principalement utilisé pour déterminer la concentration et la pureté de l'ARN, mais il ne peut pas détecter l'intégrité de l'ARN et des résidus génomiques.Parmi eux, A260/280 et A260/230 sont des paramètres importants pour la détection de la pureté de l'ARN, et la pureté de l'ARN peut être détectée en fonction de la fluctuation de leurs valeurs :

1. 1,9 < A260/280 < 2,1, indiquant que la pureté de l'ARN est bonne ;A260/280<1,9, indiquant qu'il peut y avoir un résidu protéique dans l'ARN ;A260/280>2.1, indiquant une éventuelle dégradation partielle de l'ARN, qui peut être davantage confirmée par électrophorèse sur gel d'agarose.

2. 2,0 < A260/230 < 2,2, indiquant que la pureté de l'ARN est bonne ;A260/230< 2,0, indiquant qu'il peut y avoir des résidus de réactifs organiques dans l'ARN, tels que les phénols, l'éthanol ou les sucres.

Électrophorèse sur gel d'agarose :

Le test d'électrophorèse sur gel d'agarose peut analyser l'intégrité de l'ARN, le génome et les résidus de protéines, mais ne peut pas quantifier avec précision la concentration d'ARN ou détecter les résidus de réactifs organiques.Prenez par exemple les modèles d'ARN eucaryotes :

1. L'ARN a été soumis à une électrophorèse sur gel d'agarose.S'il n'y avait que trois bandes simples de 28sRNA, 18sRNA et 5.8sRNA sur la carte du gel, cela indique que l'ARN extrait est intact.S'il y a un phénomène de traînée, cela indique une dégradation partielle de l'ARN.

2. S'il y a une seule bande brillante entre le trou de colle et la bande d'ARN 28s, il peut y avoir un résidu d'ADN génomique.

3. Si des bandes apparaissent dans le trou de colle, cela indique qu'il peut y avoir des résidus de protéines et d'autres substances macromoléculaires.

Ⅱ. Transcription inversée

Une fois l'extraction de l'ARN terminée, il doit être inversé en ADNc pour les expériences ultérieures, de sorte que l'étape d'inversion est essentielle.La transcription inverse sera introduite à partir de la sélection de la transcriptase inverse et de l'amorce :

Sélection de transcriptase inverse :

Les transcriptases inverses typiques comprennent l'AMV RTase et la MMLV RTase.La RNase H de l'AMV RTase a une forte activité, une courte durée de synthèse, une faible quantité de synthèse et une bonne stabilité thermique (42 ~ 55℃).L'activité RNase H de la MMLV RTase est faible, la durée de synthèse est longue, la quantité de synthèse est élevée et la stabilité thermique est médiocre (37 ~ 42℃).

Parce que l'enzyme RNase H a pour fonction de dégrader la matrice d'ARN, le MMLV avec une faible activité RNase H doit être préférentiellement sélectionné lors de la transcription inverse, et après le génie génétique ultérieur, la stabilité thermique du MMLV a atteint un saut qualitatif.Prendre ForegeneForeasy Reverse Transcriptase (M-MLV pour la transcription inverse) par exemple, il s'agit d'une nouvelle transcriptase inverse exprimée dans des bactéries E. coli modifiées à l'aide de la technologie de recombinaison génétique.C'est une ADN polymérase recombinante qui synthétise un brin d'ADN complémentaire à partir d'ARN simple brin, d'ADN ou d'un hybride ARN: ADN.Il n'a pas d'activité RNase H, une forte stabilité, une forte affinité ARN et une sensibilité de détection élevée.

 

Foreasy Reverse Transcriptase (M-MLV pour la transcription inverse)

Sélection de l'apprêt :

En général, les amorces RT se répartissent en trois catégories : oligo dT, amorces aléatoires et amorces spécifiques à un gène.Sélectionnez les amorces appropriées pour une utilisation en fonction des différentes exigences expérimentales.

1. Si la matrice est d'origine eucaryote et que l'ADNc tardif est utilisé pour l'amplification par PCR de routine, Oligo (dT) est recommandé ;Si l'expérience suivante n'est utilisée que pour la qPCR, il est recommandé de mélanger Oligo (dT) avec des amorces aléatoires pour améliorer l'efficacité de la transcription inverse.

2. Si la matrice provient de procaryotes, des amorces aléatoires ou des amorces spécifiques à un gène doivent être sélectionnées pour la transcription inverse.

Ⅲ.qPCR

La quantification de la fluorescence est principalement élaborée à partir de la sélection de méthodes quantitatives, des principes de conception des amorces, de la sélection ROX, de la configuration du système de réaction et du réglage des conditions de réaction, etc.

Sélection de méthodes quantitatives :

Les méthodes quantitatives sont divisées en méthodes quantitatives relatives et méthodes quantitatives absolues.La quantification relative peut être utilisée pour détecter l'effet de certaines méthodes de traitement sur l'expression génique, détecter la différence d'expression génique à différents moments et comparer la différence d'expression génique dans différents tissus.La quantification absolue peut détecter la quantité d'acide nucléique dans le virus et ainsi de suite.Lorsque nous faisons des expériences, nous devons choisir les méthodes quantitatives appropriées en fonction de nos propres expériences.

Principes de conception de l'amorce :

La conception de l'amorce pour la qPCR est directement liée à l'efficacité de l'amplification et à la spécificité du produit.Par conséquent, la conception correcte de bonnes amorces est la première étape d'une qPCR réussie.Lors de la conception d'une amorce, les principes suivants doivent être pris en compte lors du respect du principe de la conception d'une amorce conventionnelle :

1. La longueur du fragment cible est contrôlée entre 100 et 300 pb ;

2. Conception à exons croisés pour éviter l'influence de l'ADN génomique;

3. Les amorces conçues doivent être testées pour l'efficacité d'amplification, et ce n'est que lorsque l'efficacité d'amplification atteint la norme (90-110 %) qu'elles peuvent être utilisées pour des expériences quantitatives ;

4. La concentration de l'amorce est généralement optimisée entre 0,1 uM et 1,0 uM.

Sélection deROX :

Dans le processus de réaction quantitative, ROX peut ajuster uniformément la différence de chemin optique, l'erreur de pipetage ou la différence de volume causée par l'évaporation et la condensation, améliorant ainsi la répétabilité des résultats.Cependant, il convient de noter que la sélection de ROX est liée à l'instrument.Si l'instrument qPCR a pour fonction de corriger automatiquement la différence entre les trous, il n'a pas besoin d'ajouter ROX ;sinon, il doit ajouter la correction ROX.Les petits partenaires dans l'achat de réactifs doivent être en fonction de l'instrument utilisé pour choisir le bon ROX, éviter les erreurs ultérieures.

Préparation du système réactionnel :

Des volumes de réaction de 20 ul et 50 ul sont préférés.Les points suivants doivent être pris en compte lors de la formulation du système :

1. Le système de réaction doit être préparé par ventilation dans l'établi ultra-propre, nouveau ddH₂O est utilisé pour chaque expérience ;

2. Chaque expérience doit préparer le NTC pour vérifier s'il y a de la pollution dans le système, et chaque paire d'amorces doit faire le NTC lors de la préparation du système ;

3. Pour détecter s'il y a un résidu d'ADNg dans la matrice d'ARN, le NRT peut être préparé pour chaque échantillon pour la détection ;

4. Lors de la préparation du système, il est recommandé de faire au moins 3 répétitions techniques pour un échantillon ;

5. Lorsque la matrice est de l'ADNc, il est recommandé de diluer 5 à 10 fois pour réduire l'effet d'inhibition du système de transcription inverse sur l'expérience qPCR.Il est préférable d'explorer la quantité de modèle par gradient, de sorte que la valeur CT se situe entre 20 et 30 ;

6. Déterminez le nombre requis de réactions, augmentez de 5 à 10 % sur la base du nombre de réactions et calculez le numéro de configuration du volume ;

7, le système est préparé en utilisant le principe du prémélange, en mélangeant après centrifugation et en s'assurant qu'il n'y a pas de bulles ;

8, dans la mesure du possible, choisissez les consommables de support.

Kit RT-qPCR associé