La PCR quantitative par fluorescence (également connue sous le nom de TaqMan PCR, ci-après dénommée FQ-PCR) est une nouvelle technologie quantitative d'acide nucléique développée par PE (Perkin Elmer) aux États-Unis en 1995. Cette technologie est basée sur la PCR conventionnelle en ajoutant des sondes marquées par fluorescence.Par rapport à la PCR flexible, la FQ-PCR présente de nombreux avantages pour réaliser sa fonction quantitative.Cet article vise à décrire brièvement les caractéristiques, les principes, les méthodes et les applications de la technologie.
1 Caractéristiques
FQ-PCR a non seulement la haute sensibilité de la PCR ordinaire, mais aussi en raison de l'application de sondes fluorescentes, il peut détecter directement le changement de signal fluorescent pendant l'amplification PCR à travers le système de conduction photoélectrique pour obtenir des résultats quantitatifs, ce qui surmonte de nombreuses lacunes de la PCR conventionnelle, il a donc également la haute spécificité de l'hybridation de l'ADN et la haute précision de la technologie de spectroscopie.
Par exemple, les produits de PCR généraux doivent être observés par électrophorèse sur gel d'agarose et coloration au bromure d'éthidium avec une lumière ultraviolette ou par électrophorèse sur gel de polyacrylamide et coloration à l'argent.Cela nécessite non seulement plusieurs instruments, mais prend également du temps et des efforts.Les colorants utilisés Le bromure d'éthidium est nocif pour le corps humain, et ces procédures expérimentales compliquées offrent des possibilités de pollution et de faux positifs.Cependant, FQ-PCR n'a besoin d'ouvrir le couvercle qu'une seule fois pendant le chargement de l'échantillon, et le processus suivant est un fonctionnement en tube complètement fermé, qui ne nécessite pas de post-traitement PCR, évitant de nombreux inconvénients dans les opérations PCR conventionnelles.L'expérience utilise généralement le thermocycleur PCR ABI7100 développé par la société PE.
L'instrument présente les caractéristiques suivantes : ① Large application : il peut être utilisé pour la quantification des produits de PCR d'ADN et d'ARN, la recherche sur l'expression génique, la détection d'agents pathogènes et l'optimisation des conditions de PCR.② Principe quantitatif unique : à l'aide de sondes marquées par fluorescence, la quantité de fluorescence s'accumulera avec le cycle PCR après excitation laser, afin d'atteindre l'objectif de quantification.③ Efficacité de travail élevée : cycleur thermique PCR 9600 intégré, contrôlé par ordinateur 1 à 2 heures pour terminer l'amplification et la quantification de 96 échantillons automatiquement et de manière synchrone.④ Pas besoin d'électrophorèse sur gel : pas besoin de diluer et d'électrophorèse de l'échantillon, il suffit d'utiliser une sonde spéciale pour détecter directement dans le tube de réaction.⑤Pas de pollution dans le pipeline : le tube de réaction unique entièrement fermé et le système de conduction photoélectrique sont adoptés, il n'y a donc pas besoin de s'inquiéter de la pollution.⑥Les résultats sont reproductibles : la plage dynamique quantitative est jusqu'à cinq ordres de grandeur.Par conséquent, depuis que cette technologie a été développée avec succès, elle a été appréciée par de nombreux chercheurs scientifiques et a été appliquée dans de nombreux domaines.
2 Principes et méthodes
Le principe de fonctionnement de la FQ-PCR consiste à utiliser l'activité exonucléase 5′→3′ de l'enzyme Taq pour ajouter une sonde marquée par fluorescence au système de réaction PCR.La sonde peut s'hybrider spécifiquement avec la matrice d'ADN contenue dans la séquence d'amorce.L'extrémité 5' de la sonde est marquée avec le gène d'émission de fluorescence FAM (6-carboxyfluorescéine, pic d'émission de fluorescence à 518 nm), et l'extrémité 3' est marquée avec le groupe d'extinction de fluorescence TAMRA (6-carboxytétraméthylrhodamine, pic d'émission de fluorescence à 582 nm), le début 3' de la sonde est phosphorylé pour éviter que la sonde ne soit allongée pendant l'amplification par PCR.Lorsque la sonde reste intacte, le groupe extincteur supprime l'émission de fluorescence du groupe émetteur.Une fois que le groupe émetteur est séparé du groupe d'extinction, l'inhibition est levée et la densité optique à 518 nm augmente et est détectée par le système de détection de fluorescence. Dans la phase de renaturation, la sonde s'hybride avec l'ADN matrice et l'enzyme Taq dans la phase d'extension se déplace le long de la matrice d'ADN avec l'extension de l'amorce.Lorsque la sonde est coupée, l'effet d'extinction est libéré et le signal fluorescent est libéré.Chaque fois que le modèle est copié, une sonde est coupée, accompagnée de la libération d'un signal fluorescent.Puisqu'il existe une relation un à un entre le nombre de fluorophores libérés et le nombre de produits de PCR, cette technique peut être utilisée pour quantifier avec précision le modèle.L'instrument expérimental utilise généralement le thermocycleur PCR ABI7100 développé par la société PE, et d'autres thermocycleurs peuvent également être utilisés.Si le système de réaction de type réaction ABI7700 est utilisé pour l'expérience, une fois la réaction terminée, les résultats quantitatifs peuvent être directement donnés par analyse informatique.Si vous utilisez d'autres thermocycleurs, vous devez utiliser un détecteur de fluorescence pour mesurer le signal de fluorescence dans le tube de réaction en même temps pour calculer RQ+, RQ-, △RQ.RQ+ représente le rapport de l'intensité de luminescence du groupe d'émission fluorescente du tube d'échantillon à l'intensité de luminescence du groupe d'extinction, RQ- représente le rapport des deux dans le tube blanc, △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) représente la quantité de changement de signal de fluorescence pendant la PCR Après le traitement des données, des résultats quantitatifs peuvent être obtenus.En raison de l'introduction de sondes fluorescentes, la spécificité de l'expérience est considérablement améliorée.La conception de la sonde doit généralement répondre aux conditions suivantes : ①La longueur de la sonde doit être d'environ 20 à 40 bases pour garantir la spécificité de la liaison.②La teneur en bases GC est comprise entre 40 % et 60 % pour éviter la duplication de séquences nucléotidiques uniques.③ Éviter l'hybridation ou le chevauchement avec les amorces.④ La stabilité de la liaison entre la sonde et la matrice est supérieure à la stabilité de la liaison entre l'amorce et la matrice, de sorte que la valeur Tm de la sonde doit être supérieure d'au moins 5 °C à la valeur Tm de l'amorce.De plus, la concentration de la sonde, l'homologie entre la sonde et la séquence matrice, et la distance entre la sonde et l'amorce ont toutes un impact sur les résultats expérimentaux.
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Heure de publication : 15 octobre 2021
