Ⅰ. Augmenter la sensibilité du système de réaction :
1. Séparez l'ARN de haute qualité :
La synthèse réussie d'ADNc provient d'un ARN de haute qualité.L'ARN de haute qualité doit garantir au moins un total plus long et ne contient pas d'inhibiteurs qui ne contiennent pas d'enzymes d'enregistrement, telles que l'EDTA ou le SDS.La qualité de l'ARN détermine la valeur maximale des informations de séquence que vous pouvez transcrire à l'ADNc.La méthode générale de purification d'ARN est une méthode par étapes d'utilisation d'isocyanate/acidophénol.Afin d'éviter la pollution de la RNase, l'ARN séparé d'un échantillon riche en RNase (comme le pancréas) nécessite un stockage de formaldéhyde pour conserver un ARN de haute qualité, ce qui l'est encore plus pour un stockage à long terme.L'ARN extrait du foie de rat était fondamentalement dégradé après une semaine de stockage dans l'eau, tandis que l'ARN extrait de la rate de rat restait stable après trois ans de stockage dans l'eau.De plus, les transcrits de plus de 4 kb sont plus sensibles à la dégradation des traces de RNase que les petits transcrits.Afin d'augmenter la stabilité de l'échantillon d'ARN de stockage, l'ARN peut être dissous dans une méthalmamine d'ion et est stocké à -70 ° C.Le thylide utilisé pour conserver l'ARN ne doit pas contenir d'objet divers qui dégrade l'ARN.L'ARN, dérivé du pancréas, peut être conservé dans la méthalmamine pendant au moins un an.Lorsque vous êtes prêt à utiliser l'ARN, vous pouvez utiliser les méthodes suivantes pour précipiter l'ARN : ajoutez du NaCl à 0,2 m et 4 fois le volume d'éthanol, placez la température ambiante pendant 3 à 5 minutes et centrifugez 10 000 × g pendant 5 minutes.
2. Utiliser la transcriptase inverse sans activité RNaseH (RNaseH-)：
Des inhibiteurs de RNase sont souvent ajoutés aux réactions de transcription inverse pour augmenter la longueur et le rendement de la synthèse d'ADNc.L'inhibiteur de RNase est ajouté dans la première réaction de synthèse en chaîne en présence de tampons et d'agents réducteurs tels que le DTT car le processus de synthèse pré-ADNc dénature l'inhibiteur, libérant ainsi des RNases liées qui dégradent l'ARN.L'inhibiteur de la protéine RNase empêche uniquement la dégradation de l'ARN par la RNase A, B, C et n'empêche pas les RNases sur la peau, il faut donc veiller à ne pas introduire de RNases des doigts malgré l'utilisation de ces inhibiteurs.
La transcriptase inverse catalyse la conversion de l'ARN en ADNc.M-MLV et AMV ont tous deux une activité RNaseH endogène en plus de leur propre activité polymérase.L'activité RNaseH entre en compétition avec l'activité polymérase pour les brins hétérozygotes formés entre les matrices d'ARN et les amorces d'ADN ou les brins d'extension d'ADNc, et dégrade l'ARN : brins d'ARN dans les complexes d'ADN.Les matrices d'ARN dégradées par l'activité RNaseH ne peuvent plus être utilisées comme substrats efficaces pour la synthèse d'ADNc, ce qui réduit le rendement et la longueur de la synthèse d'ADNc.Ainsi, l'élimination ou la réduction importante de l'activité RNaseH de la transcriptase inverse serait d'un grand avantage.
La transcriptase inverse SuperScriptⅡ, la transcriptase inverse MMLV de la RNaseH- et la transcriptase inverse thermoScript, l'AMV de la RNaseH- ont produit plus d'ADNc complet que le MMLV et l'AMV.La sensibilité de la RT-PCR est affectée par la quantité d'ADNc synthétisée.ThermoScript est beaucoup plus sensible qu'AMV.La taille des produits de RT-PCR est limitée par la capacité de la transcriptase inverse à synthétiser l'ADNc, en particulier lors du clonage de plus grands ADNc.Par rapport au MMLV, SuperScripⅡ a considérablement augmenté le rendement des produits de RT-PCR longs.La transcriptase inverse de RNaseH- augmente également la stabilité thermique, de sorte que la réaction peut être effectuée à des températures supérieures à la normale de 37-42℃.Dans les conditions de synthèse suggérées, des amorces oligo(dT) et 10μCi [alpha-p]dCTP ont été utilisés.La production totale de la première chaîne a été calculée en utilisant la méthode de précipitation au TCA.L'ADNc de pleine longueur a été analysé à l'aide d'un retrait de bande triée par taille et d'un comptage dans un gel d'agarose alcalin.
3. Augmentez la température de conservation de la chaleur de la transcription inverse :
Une température de maintien plus élevée aide à ouvrir la structure secondaire de l'ARN et à augmenter le rendement de la réaction.Pour la plupart des matrices d'ARN, maintenir l'ARN et l'amorce à 65 °C sans tampon ni sel, puis les refroidir rapidement sur de la glace élimine la plupart des structures secondaires et permet aux amorces de se lier.Cependant, certains modèles ont encore une structure secondaire, même après dénaturation thermique.L'amplification de ces modèles difficiles peut être réalisée à l'aide de la transcriptase inverse ThermoScript et en plaçant la réaction de transcriptase inverse à des températures plus élevées pour améliorer l'amplification.Des températures de maintien plus élevées peuvent également augmenter la spécificité, en particulier lorsque la synthèse d'ADNc est effectuée à l'aide d'amorces spécifiques au gène (GSPS) (voir chapitre 3).Si vous utilisez GSP, assurez-vous que la valeur Tm de l'amorce est la même que la température de maintien attendue.Ne pas utiliser d'amorces oligo(dT) et aléatoires au-dessus de 60℃.Les amorces aléatoires doivent être maintenues à 25℃ pendant 10 minutes avant d'augmenter à 60℃.En plus d'utiliser des températures de transcription inverse plus élevées, la spécificité peut être améliorée en transférant directement le mélange ARN/amorce de la température de dénaturation de 65 ℃ à la température de maintien de la transcription inverse et en ajoutant un mélange réactionnel 2 × préchauffé (synthèse d'initiation thermique d'ADNc).Cette approche permet d'éviter l'appariement de bases intermoléculaires qui se produit à des températures plus basses.L'utilisation d'un instrument PCR simplifie les nombreux commutateurs de température requis pour la RT-PCR.
La Tth thermostabilisée polymérase agit comme ADN polymérase en présence de Mg2+ et ARN polymérase en présence de Mn2+.Il peut contenir de la chaleur jusqu'à 65 ℃.Cependant, la présence de Mn2+ pendant la PCR réduit la fidélité, ce qui rend la polymérase Tth moins adaptée à une amplification de haute précision, telle que le clonage d'ADNc.De plus, Tth est moins efficace pour la transcription inverse, ce qui réduit la sensibilité, et comme une seule enzyme peut effectuer la transcription inverse et la PCR, les réactions de contrôle sans transcription inverse ne peuvent pas être utilisées pour distinguer les produits amplifiés de l'ADNc de ceux de l'ADN génomique contaminé.
4. Additif qui favorise la transcription inverse：
L'ajout d'additifs, notamment de glycérine et de DMSO, à la première réaction de synthèse en chaîne peut réduire la stabilité du double brin d'acide nucléique et dérouler la structure secondaire de l'ARN.Jusqu'à 20% de glycérine ou 10% de DMSO peuvent être ajoutés sans affecter l'activité de SuperScriptⅡ ou MMLV.L'AMV peut également tolérer jusqu'à 20 % de glycérol sans réduire son activité.Pour maximiser la sensibilité de la RT-PCR dans la réaction de transcription inverse SuperScriptⅡ, 10 % de glycérol peuvent être ajoutés et isolés à 45 ℃.Si 1/10 du produit de la réaction de rétrotranscription est ajouté à la PCR, la concentration de glycérol dans la réaction d'amplification est de 0,4 %, ce qui n'est pas suffisant pour inhiber la PCR.
5. Traitement RNaseH：
La sensibilité peut être améliorée en traitant les réactions de synthèse d'ADNc avec la RNaseH avant la PCR.Pour certaines matrices, on pense que l'ARN dans la réaction de synthèse d'ADNc empêche la liaison des produits amplifiés, auquel cas le traitement à la RNaseH peut augmenter la sensibilité.Généralement, un traitement à la RNaseH est nécessaire pour l'amplification d'une matrice cible d'ADNc de longueur relativement longue, telle que la schérose tubéreuse Ⅱ avec une faible copie.Pour cette matrice difficile, la RNaseH a amélioré le signal généré par l'ADNc synthétisé par SuperScriptⅡ ou AMV.Pour la plupart des réactions RT-PCR, le traitement RNaseH est facultatif car l'étape de dénaturation par PCR isolée à 95°C hydrolyse généralement l'ARN du complexe ARN : ADN.
6. Méthodes améliorées pour détecter de petites quantités d'ARN：
La RT-PCR est particulièrement difficile lorsque seules de petites quantités d'ARN sont disponibles.L'ajout de glycogène comme support lors de la séparation de l'ARN permet d'augmenter le rendement des petits échantillons.Un glycogène sans RNase peut être ajouté en même temps que Trizol.Le glycogène est soluble dans l'eau et peut rester dans la phase aqueuse avec l'ARN pour aider à la précipitation ultérieure.La concentration recommandée de glycogène sans RNase est de 250 μg/ml pour les échantillons de moins de 50 mg de tissu ou 106 cellules cultivées.
L'ajout de BSA acétylé aux réactions de transcription inverse à l'aide de SuperScriptⅡ peut augmenter la sensibilité, et pour de petites quantités d'ARN, réduire la quantité de SuperScriptⅡ et ajouter 40 unités d'inhibiteur de nucléase RnaseOut peut améliorer le niveau de détection.Si le glycogène est utilisé dans la séparation de l'ARN, l'ajout d'inhibiteurs de BSA ou de RNase aux réactions de transcription inverse à l'aide de SuperScriptⅡ est toujours recommandé.
Ⅱ. Augmenter la spécificité de la RT-PCR
1. Synthèse cNDA：
Trois méthodes différentes peuvent être utilisées pour initier la synthèse d'ADNc du premier brin, et la spécificité relative de chaque méthode affecte la quantité et le type d'ADNc synthétisé.
La méthode des amorces aléatoires est la moins spécifique des trois méthodes.Les amorces sont recuites sur plusieurs sites tout au long du transcrit pour produire un ADNc court et de longueur partielle.Cette méthode est souvent utilisée pour obtenir des séquences terminales 5 'et de l'ADNc à partir de matrices d'ARN avec des régions structurelles secondaires ou avec des sites de terminaison que la transcriptase inverse ne peut pas répliquer.Pour obtenir l'ADNc le plus long, le rapport des amorces à l'ARN dans chaque échantillon d'ARN doit être déterminé de manière empirique.La concentration initiale d'amorces aléatoires varie de 50 à 250 ng par système de réaction de 20 μl.Du fait que l'ADNc synthétisé à partir d'ARN total à l'aide d'amorces aléatoires est principalement de l'ARN ribosomal, l'ARN poly(A)+ est généralement sélectionné comme matrice.
L'initiation oligo(dT) est plus spécifique que les amorces aléatoires.Il s'hybride avec la queue poly (A) trouvée à l'extrémité 3 'de l'ARNm dans la plupart des cellules eucaryotes.Étant donné que l'ARN poly(A)+ représente environ 1 à 2 % de l'ARN total, la quantité et la complexité de l'ADNc sont bien moindres que si des amorces aléatoires étaient utilisées.En raison de sa grande spécificité, l'oligo(dT) ne nécessite généralement pas d'optimisation du rapport ARN/amorce et de la sélection poly(A)+.Il est recommandé d'utiliser 0,5 μg d'oligo(dT) par système de réaction de 20 μl.oligo(dT)12-18 convient à la plupart des RT-PCR.Le système ThermoScript RT-PCR fournit de l'oligo(dT)20 en raison de sa bonne stabilité thermique et convient à des températures de maintien plus élevées.
Les amorces spécifiques au gène (GSP) sont les meilleures amorces spécifiques pour l'étape de transcription inverse.Le GSP est un oligonucléoside antisens qui peut spécifiquement s'hybrider avec des séquences de destination d'ARN, plutôt que d'hybrider tous les ARN comme des amorces aléatoires ou des oligo(dT).Les règles utilisées pour concevoir des amorces PCR s'appliquent également à la conception de la réaction de transcription inverse GSP.La GSP peut être la même séquence que l'amorce d'amplification recuite à la fin de l'ARNm3 ', ou la GSP peut être conçue pour être recuite en aval avec l'amorce d'amplification inverse.Pour certains objets amplifiés, il est nécessaire de concevoir plus d'une amorce antisens pour une RT-PCR réussie car la structure secondaire de l'ARN cible peut empêcher l'amorce de se lier.Il est suggéré d'utiliser 1 pmol de GSP antisens dans le premier système de réaction de synthèse en chaîne de 20 μl.
2. Augmentez la température de conservation de la chaleur de la transcription inverse :
Afin de tirer pleinement parti de la spécificité GSP, une transcriptase inverse à haute stabilité thermique doit être utilisée.La transcriptase inverse thermostable peut être isolée à des températures plus élevées pour augmenter la rigueur de la réaction.Par exemple, si un GSP est annelé à 55°C, alors la spécificité du GSP n'est pas pleinement utilisée si la transcription inverse est effectuée à 37°C avec une faible rigueur en utilisant AMV ou M-MLV.Cependant, SuperScripⅡ et ThermoScript peuvent réagir à 50℃ ou plus, ce qui élimine les produits non spécifiques produits à des températures plus basses.Pour une spécificité maximale, le mélange ARN / amorce peut être transféré directement de la température de dénaturation de 65 ℃ à la température de maintien de la transcription inverse avec l'ajout d'un mélange réactionnel 2 x préchauffé (initiation thermique de la synthèse d'ADNc).Cela aide à empêcher l'appariement des bases entre les molécules à basse température.L'utilisation d'un instrument PCR simplifie les nombreuses transitions de température requises pour la RT-PCR.
3. Réduire la contamination de l'ADN génomique：
Une difficulté potentielle avec la RT-PCR est que l'ARN contamine l'ADN génomique.L'utilisation de meilleures méthodes de séparation d'ARN, telles que le réactif Trizol, réduit la contamination de l'ADN génomique dans les préparations d'ARN.Pour éviter les produits fabriqués à partir d'ADN génomique, l'ARN peut être traité avec de l'ADN de qualité d'amplificationⅠ pour éliminer l'ADN contaminé avant la transcription inverse.Les échantillons ont été conservés à 65 ℃ dans 2,0 mM d'EDTA pendant 10 minutes pour terminer la digestion par la DNaseⅠ.L'EDTA chélate les ions magnésium pour empêcher l'hydrolyse de l'ARN dépendant des ions magnésium qui se produit à des températures élevées.
Afin de séparer l'ADNc amplifié du produit d'amplification de l'ADN du génome, des amorces qui s'hybrident séparément avec l'exon séparé peuvent être conçues.Les produits de PCR dérivés de l'ADNc seront plus courts que ceux dérivés de l'ADN génomique contaminé.Une expérience contrôlée sans transcription inverse est également réalisée sur chaque matrice d'ARN pour déterminer si un fragment donné provient d'ADN génomique ou d'ADNc.Les produits de PCR obtenus en l'absence de transcription inverse sont issus du génome.
Produit connexe
-Le kit en une étape permet de réaliser transcription inverse et PCR dans le même tube.Il suffit d'ajouter de l'ARN matrice, des amorces PCR spécifiques et du ddH sans RNase2O.
-L'analyse quantitative en temps réel de l'ARN peut être effectuée rapidement et avec précision.
-Le kit utilise un réactif de transcription inverse Foregene unique et l'ADN polymérase Foregene HotStar Taq combinés à un système de réaction unique pour améliorer efficacement l'efficacité de l'amplification et la spécificité de la réaction.
-Le système de réaction optimisé donne à la réaction une sensibilité de détection plus élevée, une stabilité thermique plus forte et une meilleure tolérance.
-Capacité efficace d'éliminer l'ADNg, qui peut éliminer l'ADNg dans le modèle en 2 minutes.
-Système de transcription inverse efficace, il ne faut que 15 minutes pour terminer la synthèse du premier brin d'ADNc.
-Modèles complexes : les modèles à haute teneur en GC et à structure secondaire complexe peuvent également être inversés avec une grande efficacité.
-Système de transcription inverse à haute sensibilité, les modèles de niveau pg peuvent également obtenir un ADNc de haute qualité.
-Le système de transcription inverse a une stabilité thermique élevée, la température de réaction optimale est de 42℃ et il a toujours de bonnes performances de transcription inverse à 50℃.
Heure de publication : 07 mars 2023
