Tout le monde parle du principe de l'expérience qRT-PCR, de la conception des amorces, de l'interprétation des résultats, etc., mais je pense que je devrais partager avec vous le fonctionnement expérimental de la qRT-PCR.C'est petit, mais c'est une question de résultats.
Avant de faire qRT-PCR, nous devons avoir une compréhension claire de notre propre ARN et de nos méthodes de fonctionnement.Après tout, nos efforts visent à obtenir des résultats plutôt qu'à simplement pratiquer.Donc, avant de faire qRT-PCR, nous devons déterminer les problèmes suivants (dont certains ne s'appliquent qu'à SYBR).
1 Es-tu sûr que ton ARN n'est pas dégradé ?
NanoDrop 2000 ne peut détecter que la concentration et la pureté de l'ARN, mais ne peut pas détecter l'intégrité de l'ARN.
La valeur RNA (RNA Intesity Number) peut refléter l'intégrité de l'ARN, qui est détectée par le système Agilent 2100 Bioanalyzer.
Fig. Diagramme schématique des valeurs RIN pour différents échantillons d'ARN (eucaryotes)
Cependant, les laboratoires n'ont généralement pas de bioanalyseur Agilent 2100.Dans ce cas, nous pouvons détecter à travers un gel de formaldéhyde, mais l'exigence de la quantité totale d'ARN est élevée, donc la méthode la plus rapide consiste à utiliser une électrophorèse sur gel ordinaire.Il doit être dans un environnement sans nucléase, il est donc nécessaire de rincer le réservoir d'électrophorèse, la bouteille de sol, le support de gel et le peigne avec de l'eau DEPC.L'agarose est également sans nucléase (tant qu'il est fraîchement ouvert), et le tampon de chargement doit être fraîchement ouvert autant que possible, avec 1,2 % de gel.
Notez que le gel doit être complètement dissous, sinon il provoquera des bandes inhomogènes, comme indiqué dans l'échantillon 9 de la figure.Si la tension est trop élevée ou si elle fonctionne trop longtemps, cela générera de la chaleur et entraînera une dégradation de l'ARN, de sorte que la tension et le temps doivent être contrôlés raisonnablement.De plus, le fonctionnement du gel peut également déterminer s'il y a des résidus d'ADN dans l'échantillon et observer s'il y a un grand nombre de bandes retenues dans le puits de distribution.
Chiffre.Détection d'ARN par électrophorèse sur gel
2 Êtes-vous sûr de la concentration de votre ADNc ?
L'expérience des grands frères du laboratoire est que l'ADNc du système 20 ul obtenu par chaque inversion est directement dilué 20X, tandis que les sœurs post-doctorales sont diluées 10X.Je dépends généralement de la situation.Étant donné que la qualité de l'ARN mentionnée par chaque personne est différente, le niveau d'inversion est également différent et la technologie d'inversion peut ne pas être stable.
Donc, chaque fois que j'obtiens l'ADNc inversé, je vais d'abord le diluer environ 3 fois, puis utiliser le gène de ménage pour faire une RT-PCR, le nombre de cycles est généralement de 25 cycles, pour identifier la concentration spécifique, puis déterminer le facteur de dilution final.
3 Êtes-vous sûr que vos amorces sont faciles à utiliser ?
Il peut passer la courbe de fusion de qRT-PCR, mais cela coûte toujours de l'argent.Pour les laboratoires sans beaucoup d'argent, lorsqu'ils reçoivent beaucoup d'amorces, ils peuvent utiliser la RT-PCR ordinaire pour voir s'il s'agit d'une seule bande et identifier la spécificité des amorces.Si le laboratoire n'est pas à court d'argent, la spécificité de toutes les amorces peut être identifiée une fois par la courbe de fusion.
4 Es-tu sûr que tes conditions expérimentales sont adaptées ?
Le SYBR doit être protégé de la lumière forte, essayez donc d'éteindre le plafonnier lors de l'ajout du réactif SYBR, et n'avez besoin que d'une lumière tamisée pour le compléter.
Conserver le SYBR à 4°C.Lors de l'utilisation, inverser doucement de haut en bas pour bien mélanger afin d'éviter la formation de mousse et ne pas vortexer vigoureusement.
Certaines sœurs cadettes aiment tracer des marques sur le tableau PCR de peur de mélanger les échantillons, ce qui est faux.Parce que vos marqueurs sont très susceptibles d'affecter la collecte de signaux fluorescents, je recommande généralement aux juniors d'utiliser des cahiers expérimentaux pour aider à la mémoire, comme indiqué ci-dessous.
Chiffre.Diagramme de chargement d'échantillon qRT-PCR
5 Êtes-vous sûr de bien le faire ?
Assurez-vous de porter des gants, portez des gants, portez des gants et dites trois fois des choses importantes.
Afin de réduire l'exposition de SYBR à la lumière, j'aime personnellement ajouter d'abord un modèle, comme indiqué dans la figure ci-dessous.Selon l'expérience, l'ajout d'une petite quantité de modèle est susceptible de provoquer des erreurs d'échantillonnage.Par conséquent, afin de minimiser l'erreur causée par l'ajout d'une petite quantité de modèle, je double généralement à nouveau l'échantillon et double la quantité lors de l'ajout de l'échantillon pour réduire la quantité de H2O2 ajoutée.
Chiffre.Schéma de principe du chargement qRT-PCR
Configurez ensuite le système qRT-PCR comme suit.
Chiffre.Schéma de préparation du système qRT-PCR
REMARQUE : Le processus de configuration doit être effectué sur glace.
Après avoir ajouté l'échantillon, collez le film d'étanchéité transparent.Essayez de ne pas toucher la surface du film d'étanchéité transparent avec vos mains, utilisez simplement l'espace des deux côtés du film.Parce que les empreintes digitales peuvent également affecter la collecte des signaux fluorescents.Utilisez ensuite une centrifugeuse pour centrifuger rapidement pendant 10 s à basse vitesse pour empêcher l'échantillon de s'accrocher au mur.
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Heure de publication : 28 avril 2023
