Le COVID-19 est une maladie infectieuse causée par le coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère de type 2. Lorsqu'une personne est infectée, les symptômes les plus courants sont la fièvre, la toux et l'essoufflement.

Les échantillons utilisés pour les tests peuvent être prélevés par des écouvillons nasopharyngés ou des écouvillons oropharyngés.

Qu'est-ce que la PCR ?

La méthode standard de détection des coronavirus est la réaction en chaîne par polymérase, PCR.C'est une méthode largement utilisée en biologie moléculaire.Il peut rapidement copier des millions à des milliards de fragments d'ADN spécifiques.

Le nouveau coronavirus contient un très long génome à ARN simple brin.Afin de détecter ces virus par PCR, les molécules d'ARN doivent être converties en leurs séquences d'ADN complémentaires par la transcriptase inverse, puis l'ADN nouvellement synthétisé peut être amplifié par des procédures de PCR standard, communément appelées RT-PCR.

Processus RT-PCR

Extraction d'ARN

Pour effectuer cette méthode, l'ARN viral doit essentiellement être extrait.Une variété de kits de purification d'ARN peut être utilisée pour une séparation pratique, rapide et efficace.

Pour extraire l'ARN viral à l'aide d'un kit commercial, ajoutez d'abord l'échantillon dans un tube de microcentrifugeuse, puis mélangez-le avec le tampon de lyse.Ce tampon est hautement dénaturé et se compose généralement de phénol et d'isothiocyanate de guanidine.De plus, des inhibiteurs de RNase sont généralement présents dans le tampon de lyse pour assurer l'isolement de l'ARN viral intact.

Après avoir ajouté le tampon de lyse, vortexer le tube de mélange par impulsion et incuber à température ambiante.Le virus est ensuite lysé dans des conditions hautement dénaturantes fournies par le tampon de lyse.

Une fois l'échantillon lysé, un tube à centrifuger est utilisé pour la procédure de purification.L'échantillon est chargé dans le tube de centrifugation puis centrifugé.

Cette procédure est une méthode d'extraction en phase solide dans laquelle la phase stationnaire est constituée d'une matrice de gel de silice.

Dans des conditions optimales de sel et de pH, les molécules d'ARN se lient à la membrane de silice.

En même temps, les protéines et autres contaminants sont éliminés.

Après centrifugation, placez le tube à centrifuger dans un tube de collecte propre, jetez le filtrat, puis ajoutez le tampon de lavage.

Placer à nouveau le tube dans la centrifugeuse pour forcer le tampon de lavage à travers la membrane.Cela éliminera toutes les impuretés restantes de la membrane, ne laissant que l'ARN lié au gel de silice.

Une fois l'échantillon lavé, placez le tube dans un tube de microcentrifugeuse propre et ajoutez le tampon d'élution.

Il est ensuite centrifugé pour forcer le tampon d'élution à travers la membrane.Le tampon d'élution élimine l'ARN viral de la colonne de centrifugation et obtient un ARN purifié exempt de protéines, d'inhibiteurs et d'autres contaminants.

ÉTAPE 2

Concentré mixte

Après avoir extrait l'ARN viral, l'étape suivante consiste à préparer le mélange réactionnel pour l'amplification par PCR.Dans cette étape, le concentré est utilisé.Cette solution concentrée est une solution concentrée prémélangée composée d'un prémélange, d'une transcriptase inverse, de nucléotides, d'une amorce directe, d'une amorce inverse, d'une sonde TaqMan et d'une ADN polymérase.

Enfin, pour compléter ce mélange réactionnel, la matrice d'ARN est ajoutée.Les tubes sont mélangés par vortex pulsé, puis le mélange réactionnel est chargé dans la plaque PCR.La plaque PCR contient généralement 96 puits et peut analyser plusieurs échantillons en même temps.

ÉTAPE 3

Amplification PCR

Ensuite, placez la plaque dans la machine PCR, qui est essentiellement un thermocycleur.

La RT-PCR en temps réel est utilisée pour détecter le nouveau coronavirus 2019 en amplifiant la séquence cible dans le gène RdrRP, le gène E et le gène N.Le choix du gène cible dépend de la séquence de l'amorce et de la sonde.

La première étape de la RT-PCR est la transcription inverse.Le premier brin d'ADN complémentaire est synthétisé, qui est initié par l'amorce inverse PCR, qui se lie à la partie complémentaire du génome de l'ARN viral.Ensuite, la transcriptase inverse ajoute des nucléotides d'ADN à l'extrémité 3 'de l'amorce pour synthétiser l'ADN complémentaire de l'ARN viral.La température et la durée de cette étape dépendent des amorces, de l'ARN cible et de la transcriptase inverse utilisées.

Ensuite, une étape initiale de dénaturation est appliquée, qui aboutit à la dénaturation de l'hybride ARN-ADN.Cette étape est nécessaire pour activer l'ADN polymérase.Dans le même temps, la transcriptase inverse est inactivée.

La PCR consiste en une série de cycles thermiques.Chaque cycle comprend des étapes de dénaturation, d'hybridation et d'extension.

L'étape de dénaturation consiste à chauffer la chambre de réaction à 95 degrés Celsius et à l'utiliser pour la dénaturation de la matrice d'ADN double brin.

Dans l'étape suivante, la température de réaction est réduite à 58 degrés Celsius, permettant à l'amorce sens de s'hybrider à la partie complémentaire de sa matrice d'ADN simple brin.La température de recuit dépend directement de la longueur et de la composition de l'amorce.

Dans l'étape d'extension, l'ADN polymérase synthétise un nouveau brin d'ADN qui est complémentaire du brin matrice d'ADN.En ajoutant des noyaux libres complémentaires à la matrice dans le sens 5' vers 3' à partir du mélange réactionnel.La température de cette étape dépend de l'ADN polymérase utilisée.

Après le premier cycle, une cible d'ADN double brin est obtenue.

Ensuite, entrez dans le deuxième cycle.L'ADN double brin est dénaturé pour produire deux molécules d'ADN simple brin.

Dans l'étape suivante, la température de réaction est abaissée, les amorces sont annelées à chaque matrice d'ADN simple brin et la sonde Taq-man est annelée à la partie complémentaire de l'ADN cible.

La sonde TaqMan est constituée d'un fluorophore lié de manière covalente à l'extrémité 5' de la sonde oligonucléotidique.Lorsqu'il est excité par la source lumineuse du cycleur, le fluorophore émet une fluorescence.De plus, la sonde est composée d'un quencher en 3'.La proximité du gène rapporteur avec l'extincteur empêche la détection de la fluorescence.

Dans l'étape d'extension, l'ADN polymérase synthétise un nouveau brin.Lorsque la polymérase atteint la sonde TaqMan, son activité 5'nucléase endogène clive la sonde, séparant le colorant de l'extincteur.

À chaque cycle de PCR, davantage de molécules de colorant sont libérées, ce qui entraîne une augmentation de l'intensité de fluorescence proportionnelle au nombre d'amplicons synthétisés.

Cette méthode permet d'estimer le nombre d'une séquence donnée présente dans l'échantillon.Le nombre de fragments d'ADN double brin double à chaque cycle.Par conséquent, la PCR peut être utilisée pour analyser de très petits échantillons.

Pour mesurer le signal fluorescent, la lampe halogène au tungstène, le filtre d'excitation, le réflecteur, la lentille, le filtre d'émission et la caméra CCD à couplage de charge.

ÉTAPE 4 Détecter

Pour mesurer le signal fluorescent, la lampe halogène au tungstène, le filtre d'excitation, le réflecteur, la lentille, le filtre d'émission et la caméra CCD à couplage de charge.

La lumière filtrée de la lampe est réfléchie par le réflecteur, passe à travers la lentille du condenseur et est focalisée au centre de chaque trou.Ensuite, la fluorescence émise par le trou est réfléchie par le miroir, passe à travers le filtre d'émission et est détectée par la caméra CCD.Dans chaque cycle de PCR, la lumière fluorophore auto-excitée peut être détectée par le CCD.

Il convertit la lumière captée en données numériques.Cette méthode est appelée PCR en temps réel et permet de suivre en temps réel la progression de la réaction PCR.