La RT-qPCR est l'expérience de base de la biologie moléculaire, et tout le monde doit la connaître.Il comprend principalement trois étapes : extraction de l'ARN, transcription inverse en ADNc et PCR quantitative fluorescente en temps réel.Ça ne sert à rien, que se passe-t-il ?Il est probable qu'il y ait un problème avecl'expérience de transcription inverse!Bien qu'il semble que l'expérience de transcription inverse n'ait besoin que d'ajouter de l'ARN, du dNTP, des amorces ettranscriptase inverseau tube de centrifugation et bien mélanger, mais dans le processus de fonctionnement réel, il y a encore de nombreux détails auxquels il faut prêter attention.Apprenons-le !

Comment juger de la qualité de l'ARN ?
Pour obtenir de l'ADNc, la qualité de l'ARN est primordiale !La qualité de l'ARN peut être détectée principalement sous deux aspects :
(1) Intégrité de l'ARN :L'intégrité de l'ARN peut être vérifiée par électrophorèse sur gel d'agarose. En prenant les eucaryotes comme exemple, l'ARN total complet a trois bandes claires, les poids moléculaires de grand à petit sont 28S, 18S et 5S, et 28S est deux fois plus brillant que 18S ;si trois bandes sont visibles, mais que le type de bande est flou ou Diffusion signifie que l'ARN est partiellement dégradé.À ce stade, veuillez effectuer immédiatement la réaction de transcription inverse et augmenter l'entrée du modèle de manière appropriée ;si seule une bande de faible poids moléculaire ou aucune bande est visible, l'ARN a été complètement dégradé et doit être réextrait .Agilent 2100 indique l'intégrité de l'ARN avec le diagramme des pics et la valeur RIN.Si l'acide nucléique est intact, la ligne de base de l'électrophérogramme est plate ;si l'acide nucléique est sévèrement dégradé, la ligne de base est inégale et davantage de pics de dégradation apparaissent ;la valeur de RIN reflète l'intégrité de l'ARN, dans la plage de 0 à 10, plus la valeur est grande, meilleure est la qualité de l'ARN.Eh bien, plus le degré d'exhaustivité est élevé.
(2) Pureté de l'ARN :Le rapport DO260/280 peut être détecté par spectrophotométrie UV.Si le rapport OD260/280 est compris entre 1,9 et 2,1, la pureté est très bonne.
L'ADN génomique résiduel peut conduire à des résultats quantitatifs inexacts
Lorsque l'ARN est extrait, l'ARN que nous obtenons peut être mélangé avec de l'ADN génomique (ADNg) qui n'a pas été nettoyé.Par conséquent, l'ADNc après transcription inverse sera également mélangé avecADNg.Pendant l'avalqPCRréaction,ADNcet l'ADNg peut être amplifié simultanément, ce qui donne une valeur CT relativement faible, de sorte que les résultats peuvent être biaisés.
Alors que devons-nous faire dans cette situation ?Prégènesuggère :
(1) Effectuez le nettoyage du génome sur l'ARN inversé, qui peut être retiré par extraction sur colonne lors de l'extraction de l'ARN ;
(2) Traiter l'ARN extrait avec de la DNaseI , mais terminez-le avec EDTA ;
de réactifs de transcription inverseavec des modules de compensation du génome ;

Comment choisir les amorces pour la transcription inverse ?
Les amorces de transcription inverse affectent également le résultat de la réaction de transcription inverse.Vous pouvez choisir des amorces aléatoires, Oligo dT ou des amorces spécifiques à un gène pour la transcription inverse en fonction des circonstances spécifiques de l'expérience :
(1) Transcriptions spécifiques: des amorces spécifiques au gène sont recommandées ;
(2) Transcriptions de longs fragments: Des amorces oligo dT/gène spécifiques sont recommandées ;
(3) Fragments internes de transcriptions à long segment: amorces spécifiques au gène / amorces aléatoires / amorces aléatoires + Oligo dT.Si l'expérience qPCR suivante est effectuée, Oligo dT ne peut pas être utilisé seul, car l'utilisation d'Oligo dT seul peut provoquer un biais à l'extrémité 3 ', entraînant des résultats d'expérience qPCR inexacts ;
(4) miARN: Des amorces de tige-boucle ou des amorces de queue peuvent être utilisées.

Combien de fois l'ADNc du produit de transcription inverse doit-il être dilué pour la quantification ?
Après avoir obtenu l'ADNc du produit de transcription inverse, combien de fois l'ADNc doit être dilué pour les expériences de qPCR est très important.Si la concentration d'ADNc est trop élevée ou trop faible, l'efficacité de l'amplification peut être affectée.La concentration d'ADNc peut-elle être mesurée, et comment doit-elle être faite ?
(1) La concentration d'ADNc du produit de transcription inverse ne peut pas être mesurée, car en plus du produit d'ADNc, le produit de transcription inverse contient également un tampon résiduel de transcription inverse, une transcriptase inverse, des amorces, etc., ce qui interférera avec les résultats de mesure de la concentration et provoquera un rapport OD260/280, OD260/230 anormal et ne reflète donc pas le véritable rendement en ADNc.A ce moment-là, diront certains amis, alors je mesurerai la concentration après purification;Ici, Foregene tient à rappeler qu'il n'est pas recommandé de purifier l'ADNc, car la longueur de l'ADNc obtenu par l'inversion est différente et l'ADNc court sera perdu lors de la purification.
(2) Alors que faire ?Avant l'expérience qPCR, le gradient de dilution de l'ADNc peut être déterminé par la pré-expérience .Par exemple : utilisez une solution mère d'ADNc, une dilution de 10 fois et une dilution de 100 fois comme modèles pour les expériences de qPCR, et sélectionnez le facteur de dilution avec une valeur CT dans la plage de 18 à 28.

Comment les miARN doivent-ils être rétrotranscrits ?
Le miARN est une petite molécule d'ARN simple brin d'une taille d'environ 22 nt qui ne code pas pour une protéine.En raison de sa courte longueur, la méthode qPCR conventionnelle est difficile à quantifier directement, il est donc souvent nécessaire d'étendre le miARN ;les méthodes de transcription inverse couramment utilisées pour les miARN comprennent la méthode tige-boucle et la méthode de queue.
La méthode tige-boucle consiste à étendre le miARN en ajoutant des amorces tige-boucle.Cette méthode de détection a une sensibilité et une spécificité plus élevées, mais le débit de détection est faible.Une transcription inverse ne peut détecter qu'un seul miARN et une référence interne ;la méthode d'ajout de queue est composée de deux Elle est complétée par l'action conjointe de deux enzymes, qui sont la PolyA polymérase et la transcriptase inverse.La polymérase PolyA est responsable de l'ajout de queues PolyA au miARN pour augmenter sa longueur, et la transcriptase inverse effectue une réaction de transcription inverse.Cette méthode a un débit de détection élevé et peut détecter plusieurs miARN et références internes dans une transcription inverse, mais la sensibilité et la spécificité sont faibles dans la méthode tige-boucle.