La valeur Ct est la forme de présentation des résultats la plus importante de la PCR quantitative fluorescente.Il est utilisé pour calculer les différences d'expression des gènes ou le nombre de copies de gènes.Alors, quelle est la valeur Ct de la quantification de la fluorescence considérée comme raisonnable ?Comment garantir la plage effective de la valeur Ct ?
Qu'est-ce que la valeur Ct ?
Au cours du processus d'amplification qPCR, le nombre correspondant de cycles d'amplification (Cycle Threshold) lorsque le signal de fluorescence du produit amplifié atteint le seuil de fluorescence défini.C signifie Cycle et T signifie Seuil.En termes simples, la valeur Ct est le nombre de cycles correspondant au moment où l'amplification initiale de la matrice atteint une certaine quantité de produit en qPCR.Le soi-disant "une certaine quantité de produit" sera expliqué plus en détail plus tard.
A quoi sert la valeur Ct ?
1. Relation entre l'amplification exponentielle, la quantité de modèle et la valeur Ct
Idéalement, les gènes en qPCR sont accumulés par amplification exponentielle après un certain nombre de cycles.La relation entre le nombre de cycles d'amplification et la quantité de produits est la suivante : quantité de produit amplifié = quantité de matrice initiale × (1+En) nombre de cycles.Cependant, la réaction qPCR n'est pas toujours dans une situation idéale.Lorsque la quantité de produit amplifié atteint une "certaine quantité de produit", le nombre de cycles à ce moment est la valeur Ct, et il se trouve dans la période d'amplification exponentielle.La relation entre la valeur Ct et la quantité de modèle de départ : il existe une relation linéaire entre la valeur Ct du modèle et le logarithme du nombre de copies de départ du modèle.Plus la concentration initiale de matrice est élevée, plus la valeur Ct est faible ;plus la concentration initiale du modèle est faible, plus la valeur Ct est élevée.
2. Courbe d'amplification, seuil de fluorescence et certaine quantité de produit PCR
La quantité de produit d'amplification qPCR est directement présentée sous forme de signal fluorescent, c'est-à-dire la courbe d'amplification.Au stade précoce de la PCR, l'amplification est dans des conditions idéales, le nombre de cycles est faible, l'accumulation de produit est faible et le niveau de fluorescence ne peut pas être clairement distingué du fond de fluorescence.Après cela, la fluorescence augmente et entre dans la phase exponentielle.La quantité de produit PCR peut être détectée à un certain moment où la réaction PCR est juste dans la phase exponentielle, qui peut être utilisée comme "une certaine quantité de produit", et le contenu initial de la matrice peut en être déduit.Par conséquent, l'intensité du signal de fluorescence correspondant à une certaine quantité de produit est le seuil de fluorescence.
Au stade tardif de la PCR, la courbe d'amplification ne montre plus d'amplification exponentielle et entre dans la phase linéaire et la phase de plateau.
3. Reproductibilité des valeurs Ct
Lorsque le cycle PCR atteint le numéro de cycle de la valeur Ct, il vient d'entrer dans la véritable période d'amplification exponentielle.À ce stade, la petite erreur n'a pas été amplifiée, de sorte que la reproductibilité de la valeur Ct est excellente, c'est-à-dire que le même modèle est amplifié à différents moments ou dans différents tubes en même temps.Amplification, la valeur Ct obtenue est constante.
1. Efficacité d'amplification En
L'efficacité d'amplification par PCR fait référence à l'efficacité avec laquelle la polymérase convertit le gène à amplifier en un amplicon.L'efficacité d'amplification lorsqu'une molécule d'ADN est transformée en deux molécules d'ADN est de 100 %.L'efficacité d'amplification est communément exprimée en En.Afin de faciliter l'analyse des articles suivants, les facteurs qui affectent l'efficacité d'amplification sont brièvement introduits.
| Facteurs qui influencent | explication | Comment juger ? |
| A. Inhibiteurs de la PCR | 1. L'ADN matrice contient des substances qui inhibent la réaction PCR, telles que des protéines ou des détergents.2. L'ADNc après transcription inverse contient une concentration élevée d'ARN matrice ou de composants réactifs RT, qui peuvent également inhiber la réaction PCR ultérieure. | 1. L'existence ou non d'une pollution peut être jugée en mesurant le rapport A260/A280 et A260/A230 ou l'électrophorèse de l'ARN.2. Si l'ADNc est dilué selon un certain rapport après transcription inverse. |
| B. Mauvaise conception de l'amorce | Les amorces ne se recuisent pas efficacement | Vérifiez les amorces pour les dimères d'amorces ou les épingles à cheveux, les décalages et parfois les conceptions introniques. |
| C. Conception incorrecte du programme de réaction PCR | 1. Les amorces ne peuvent pas recuit efficacement2. Libération insuffisante d'ADN polymérase 3. L'activité de l'ADN polymérase à haute température à long terme a diminué | 1. La température de recuit est supérieure à la valeur TM de l'amorce2. Le temps de pré-dénaturation est trop court 3. Le temps de chaque étape de la procédure de réaction est trop long |
| D. Mélange insuffisant des réactifs ou erreurs de pipetage | Dans le système de réaction, la concentration locale des composants de la réaction PCR est trop élevée ou inégale, ce qui entraîne une amplification non exponentielle de l'amplification PCR | |
| E. Longueur de l'amplicon | La longueur de l'amplicon est trop longue, dépassant 300bp, et l'efficacité d'amplification est faible | Vérifiez que la longueur de l'amplicon est comprise entre 80 et 300 bp |
| F. Influence des réactifs qPCR | La concentration d'ADN polymérase dans le réactif est faible ou la concentration d'ions dans le tampon n'est pas optimisée, ce qui fait que l'activité enzymatique Taq n'atteint pas le maximum | Détermination de l'efficacité d'amplification par courbe standard |
2. Plage de valeurs Ct
Les valeurs Ct vont de 15 à 35.Si la valeur Ct est inférieure à 15, on considère que l'amplification se situe dans la plage de la période de référence et que le seuil de fluorescence n'a pas été atteint.Idéalement, il existe une relation linéaire entre la valeur Ct et le logarithme du nombre de copies initial du modèle, c'est-à-dire la courbe standard.Grâce à la courbe standard, lorsque l'efficacité d'amplification est de 100%, la valeur Ct calculée pour quantifier le nombre de copies uniques du gène est d'environ 35. S'il est supérieur à 35, le nombre de copies initial du modèle est théoriquement inférieur à 1, ce qui peut être considéré comme sans signification.
Pour différentes plages de gène Ct, en raison de la différence de nombre de copies de gène et d'efficacité d'amplification dans la quantité de matrice initiale, il est nécessaire de créer une courbe standard pour le gène et de calculer la plage de détection linéaire du gène.
3. Facteurs d'influence de la valeur Ct
D'après la relation entre le nombre de cycles d'amplification et la quantité de produit : quantité de produit amplifié = quantité de modèle initial × (1 + En) nombre de cycles, on peut voir que dans des conditions idéales, la quantité de modèle initial et En aura un impact négatif sur la valeur Ct est affectée.La différence de qualité de modèle ou d'efficacité d'amplification entraînera une valeur Ct trop grande ou trop petite.
4. La valeur Ct est trop grande ou trop petite
Heure de publication : 22 février 2023
