La technologie de diagnostic moléculaire utilise des méthodes de biologie moléculaire pour détecter l'expression et la structure du matériel génétique du corps humain et de divers agents pathogènes, afin d'atteindre l'objectif de prédiction et de diagnostic des maladies.

Ces dernières années, avec la mise à niveau et l'itération de la technologie de diagnostic moléculaire, l'application clinique du diagnostic moléculaire est devenue de plus en plus étendue et approfondie, et le marché du diagnostic moléculaire est entré dans une période de développement rapide.

L'auteur résume les technologies de diagnostic moléculaire courantes sur le marché et se divise en trois parties : la première partie présente la technologie PCR, la deuxième partie présente la technologie d'amplification isotherme des acides nucléiques et la deuxième partie présente la technologie de séquençage.

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Partie I : Technologie PCR

Technologie PCR

La PCR (amplification en chaîne par polymérase) est l'une des technologies d'amplification in vitro de l'ADN, avec une histoire de plus de 30 ans.

La technologie PCR a été mise au point en 1983 par Kary Mullis de Cetus, aux États-Unis.Mullis a déposé une demande de brevet PCR en 1985 et a publié le premier article académique PCR sur la science la même année.Mullis a remporté le prix Nobel de chimie en 1993.

Principes de base de la PCR

La PCR peut amplifier des fragments d'ADN cibles de plus d'un million de fois.Le principe est que sous la catalyse de l'ADN polymérase, le brin d'ADN parent est utilisé comme matrice et une amorce spécifique est utilisée comme point de départ pour l'extension.Il est répliqué in vitro par des étapes telles que la dénaturation, l'hybridation et l'extension.Le processus d'ADN du brin fille complémentaire de l'ADN matrice du brin parent.

Le processus standard de PCR est divisé en trois étapes :

1. Dénaturation : Utilisez une température élevée pour séparer les doubles brins d'ADN.Les liaisons hydrogène entre les doubles brins d'ADN sont rompues à des températures élevées (93-98°C).

2. Recuit : Une fois l'ADN double brin séparé, la température est abaissée afin que l'amorce puisse se lier à l'ADN simple brin.

3. Extension : L'ADN polymérase commence à synthétiser des brins complémentaires le long des brins d'ADN à partir des amorces liées lorsque la température est abaissée.Lorsque l'extension est terminée, un cycle est terminé et le nombre de fragments d'ADN double.

En effectuant ces trois étapes en va-et-vient 25 à 35 fois, le nombre de fragments d'ADN augmentera de façon exponentielle.

L'ingéniosité de la PCR réside dans le fait que différentes amorces peuvent être conçues pour différents gènes cibles, de sorte que les fragments de gènes cibles peuvent être amplifiés en peu de temps.

Jusqu'à présent, la PCR peut être divisée en trois catégories, à savoir la PCR ordinaire, la PCR quantitative fluorescente et la PCR numérique.

La première génération de PCR ordinaire

Utilisez un instrument d'amplification PCR ordinaire pour amplifier le gène cible, puis utilisez une électrophorèse sur gel d'agarose pour détecter le produit, seule une analyse qualitative peut être effectuée.

Les principaux inconvénients de la PCR de première génération :

-Sujet à une amplification non spécifique et à des résultats faussement positifs.

-La détection prend beaucoup de temps et l'opération est lourde.

- Seuls des tests qualitatifs peuvent être effectués.

PCR quantitative de fluorescence de deuxième génération

La PCR quantitative de fluorescence (PCR en temps réel), également connue sous le nom de qPCR, est utilisée pour surveiller l'accumulation de produits amplifiés par l'accumulation de signaux fluorescents en ajoutant des sondes fluorescentes qui peuvent indiquer la progression du système de réaction, et pour juger les résultats à travers la courbe de fluorescence, et il peut être quantifié à l'aide de la valeur Cq et de la courbe standard.

Parce que la technologie qPCR est réalisée dans un système fermé, la probabilité de contamination est réduite et le signal de fluorescence peut être surveillé pour une détection quantitative, il est donc le plus largement utilisé en pratique clinique et est devenu la technologie dominante en PCR.

Les substances fluorescentes utilisées dans la PCR quantitative fluorescente en temps réel peuvent être divisées en : sondes fluorescentes TaqMan, balises moléculaires et colorants fluorescents.

1) Sonde fluorescente TaqMan :

Lors de l'amplification par PCR, une sonde fluorescente spécifique est ajoutée tout en ajoutant une paire d'amorces.La sonde est un oligonucléotide, et les deux extrémités sont respectivement marquées avec un groupe fluorescent reporter et un groupe fluorescent quencher.

Lorsque la sonde est intacte, le signal fluorescent émis par le groupe rapporteur est absorbé par le groupe quenching ;lors de l'amplification par PCR, l'activité exonucléase 5′-3′ de l'enzyme Taq clive et dégrade la sonde, rendant le groupe rapporteur fluorescent et l'extincteur. Le groupe fluorescent est séparé, de sorte que le système de surveillance de la fluorescence puisse recevoir le signal de fluorescence, c'est-à-dire qu'à chaque fois qu'un brin d'ADN est amplifié, une molécule fluorescente se forme et l'accumulation du signal de fluorescence est complètement synchronisée avec la formation du produit PCR.

2) Colorants fluorescents SYBR :

Dans le système de réaction PCR, un excès de colorant fluorescent SYBR est ajouté.Une fois que le colorant fluorescent SYBR est incorporé de manière non spécifique dans le double brin d'ADN, il émet un signal fluorescent.La molécule de colorant SYBR qui n'est pas incorporée dans la chaîne n'émettra aucun signal fluorescent, assurant ainsi le signal fluorescent. L'augmentation des produits de PCR est complètement synchronisée avec l'augmentation des produits de PCR.Le SYBR ne se lie qu'à l'ADN double brin, de sorte que la courbe de fusion peut être utilisée pour déterminer si la réaction PCR est spécifique.

3) Balises moléculaires

Il s'agit d'une sonde oligonucléotidique à double marquage tige-boucle qui forme une structure en épingle à cheveux d'environ 8 bases aux extrémités 5 et 3.Les séquences d'acide nucléique aux deux extrémités sont appariées de manière complémentaire, ce qui fait que le groupe fluorescent et le groupe d'extinction sont serrés.Fermer, il ne produira pas de fluorescence.

Une fois le produit de PCR généré, pendant le processus d'hybridation, la partie médiane de la balise moléculaire est associée à une séquence d'ADN spécifique et le gène fluorescent est séparé du gène quencher pour produire une fluorescence.

Les principaux inconvénients de la PCR de seconde génération :

La sensibilité fait toujours défaut et la détection des spécimens à faible nombre de copies n'est pas précise.

Il y a une influence de la valeur de fond et le résultat est sensible aux interférences.

PCR numérique de troisième génération

La PCR numérique (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) calcule le nombre de copies de la séquence cible grâce à la détection du point final et peut effectuer une détection quantitative absolue précise sans utiliser de contrôles internes ni de courbes standard.

La PCR numérique utilise la détection du point final et ne dépend pas de la valeur Ct (seuil de cycle), de sorte que la réaction PCR numérique est moins affectée par l'efficacité de l'amplification et la tolérance aux inhibiteurs de la réaction PCR est améliorée, avec une précision et une reproductibilité élevées.

En raison des caractéristiques de haute sensibilité et de haute précision, il n'est pas facilement interféré par les inhibiteurs de réaction PCR, et il peut réaliser une véritable quantification absolue sans produits standard, qui est devenu un point chaud de recherche et d'application.

Selon les différentes formes de l'unité de réaction, celle-ci peut être divisée en trois types : systèmes microfluidiques, puces et gouttelettes.