Dans les expériences de qPCR, la conception des amorces est également un lien très important.Que les amorces conviennent ou non est étroitement lié au fait que l'efficacité d'amplification atteint la norme, que les produits amplifiés soient spécifiques et que les résultats expérimentaux soient disponibles.
Alors, comment améliorer la spécificité des amorces qPCR ?Haut rendement d'amplification ?
Aujourd'hui, nous vous amènerons à concevoir ensemble des amorces qPCR et laisserons la conception d'amorces qPCR devenir une compétence efficace dans les expériences.
Lors de la conception des amorces qPCR, faites généralement attention aux points suivants : les amorces doivent être conçues autant que possible sur les introns, la longueur du produit doit être de 100 à 300 bp, la valeur Tm doit être aussi proche que possible de 60°C, et les amorces en amont et en aval doivent être aussi proches que possible, et la fin de l'amorce doit être G ou C, etc. attendez.
1. Conception d'amorces couvrant des introns
Lors de la conception d'amorces qPCR, le choix d'amorces conçues sur des introns peut empêcher l'amplification de la matrice d'ADNg, et les produits sont tous dérivés de l'amplification de l'ADNc, éliminant ainsi l'influence de la contamination par l'ADNg.
2. Longueur d'amorce
La longueur de l'amorce est généralement comprise entre 18 et 30 nt, et la longueur du produit d'amplification doit être contrôlée entre 100 et 300 pb autant que possible.
Si l'amorce est trop courte, elle conduira à une amplification non spécifique, et si elle est trop longue, elle formera facilement une structure secondaire (telle qu'une structure en épingle à cheveux).Si le produit d'amplification est trop long, il n'est pas adapté à la réaction de la polymérase, ce qui affectera l'efficacité de l'amplification PCR.
3. Teneur en GC et valeur Tm
La teneur en GC des amorces doit être contrôlée entre 40% et 60%.Si elle est trop élevée ou trop faible, elle n'est pas propice à l'initiation de la réaction.La teneur en GC des amorces directes et inverses doit être proche de la même afin d'obtenir la même valeur de Tm et la même température de recuit.
La valeur Tm doit être comprise entre 55 et 65°C autant que possible, généralement autour de 60°C, et la valeur Tm de l'amont et de l'aval doit être aussi proche que possible, de préférence pas supérieure à 4°C.
4. Évitez de sélectionner A à l'extrémité 3 'de l'amorce
Lorsque l'extrémité 3 'de l'amorce est désadaptée, il existe de grandes différences dans l'efficacité de synthèse des différentes bases.Lorsque la dernière base est A, elle peut également initier la synthèse de chaîne même en cas de mésappariement, et lorsque la dernière base est T When , l'efficacité de l'induction des mésappariements est fortement réduite.Par conséquent, essayez d'éviter de choisir A à l'extrémité 3 'de l'amorce, et il est préférable de choisir T.
S'il s'agit d'une amorce de sonde, l'extrémité 5 'de la sonde ne peut pas être G, car même lorsqu'une seule base G est connectée au groupe rapporteur fluorescent FAM, G peut également éteindre le signal fluorescent émis par le groupe FAM, entraînant de faux résultats négatifs.Apparaître.
5. Répartition de base
La répartition des quatre bases dans l'amorce est de préférence aléatoire, en évitant plus de 3 G ou C consécutifs à l'extrémité 3', et plus de 3 consécutifsG ou C sont faciles à générer un appariement dans la région de séquence riche en GC.
6. La région de conception de l'amorce doit éviter les structures secondaires complexes.
La structure secondaire formée par le simple brin du produit d'amplification affectera le bon déroulement de la PCR.En prédisant à l'avance s'il existe une structure secondaire dans la séquence cible, essayez d'éviter cette région dans la conception des amorces.
7. Les amorces elles-mêmes et entre les amorces doivent essayer d'éviter les bases complémentaires consécutives.
Il ne peut y avoir de complémentarité de 4 bases consécutives entre l'amorce elle-même et l'amorce.L'amorce elle-même ne doit pas avoir de séquence complémentaire, sinon elle se repliera pour former une structure en épingle à cheveux, ce qui affectera la combinaison de recuit de l'amorce et de la matrice.
Des séquences complémentaires ne peuvent pas exister entre les amorces en amont et en aval.La complémentarité entre les amorces produira des dimères d'amorces, ce qui réduira l'efficacité de la PCR et affectera même la précision quantitative.Si les structures amorce-dimère et épingle à cheveux sont inévitables, la valeur △G ne doit pas être trop élevée (doit être inférieure à 4,5 kcal/mol).
8. Les amorces amplifient le produit spécifique cible.
Le but ultime de la détection qPCR est de comprendre l'abondance du gène cible.Si une amplification non spécifique se produit, la quantification sera inexacte.Par conséquent, une fois les amorces conçues, elles doivent être testées par BLAST et la spécificité des produits est comparée dans la base de données de séquences.
Ensuite, nous prenons le gène humain GAS6 (Growth stop specific 6) comme exemple pour concevoir des amorces qPCR.
01 gène de requête
Homo GAS6par l'intermédiaire du NCBI.Ici, nous devons faire attention à comparer le nom du gène et l'espèce pour nous assurer qu'ils sont cohérents.
02 Trouver la séquence du gène
(1) Si la séquence cible est l'ADN génomique, sélectionnez la première, qui est la séquence d'ADN génomique du gène.
(2) Si la séquence cible est l'ARNm, sélectionnez la seconde.Après avoir entré, cliquez sur "CDS" dans le tableau ci-dessous.La séquence de fond marron est la séquence codante du gène.
03 Abécédaires de conception
Entrez dans l'interface Primer-BLAST
Entrez le numéro de séquence du gène ou la séquence au format Fasta en haut à gauche et remplissez les paramètres pertinents.

Cliquez sur "Get Primers" et NCBI apparaîtra pour vous dire que cette sélection de paramètres sera amplifiée pour d'autres variantes d'épissage.Nous pouvons vérifier les différentes variantes d'épissage et les soumettre pour obtenir la paire d'amorces appropriée (comme indiqué dans la figure ci-dessous).Ce processus peut prendre des dizaines de secondes pour s'exécuter.
Les températures de recuit de ces paires d'amorces sont toutes autour de 60°C.Selon le but de l'expérience, choisissez des amorces de longueur modérée, une bonne spécificité et moins d'auto-complémentation des amorces pour l'expérience, et le taux de réussite est assez élevé !
04Vérification de la spécificité des amorces
En fait, en plus de concevoir des amorces, Primer-Blast peut également évaluer les amorces que nous avons conçues nous-mêmes.Revenez à la page de conception des amorces, entrez les amorces en amont et en aval que nous avons conçues, et les autres paramètres ne seront pas ajustés.Après la soumission, vous pouvez voir si la paire d'amorces existe également sur d'autres gènes.Si elles sont toutes affichées sur le gène que nous voulons amplifier, cela indique que la spécificité de cette paire d'amorces est grande !(Par exemple, c'est le seul résultat de la requête primaire !)

05 Jugement de la qualité des amorces
Quel type d'amorce est l'amorce "parfaite" qui combine "efficacité d'amplification conforme aux normes", "caractéristiques du produit amplifié" et "résultats expérimentaux fiables" ?
Efficacité d'amplification

courbe de fusion
L'efficacité d'amplification des amorces atteint 90 % à 110 %, ce qui signifie que l'efficacité d'amplification est bonne, et la courbe de fusion a un seul pic et généralement Tm> 80 °C, ce qui signifie que la spécificité d'amplification est bonne.
 
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