Base de conception de l'amorce (99 % des problèmes peuvent être résolus)
1. Longueur de l'amorce : le manuel nécessite 15 à 30 bp, généralement environ 20 bp.La condition réelle est préférable d'être de 18 à 24 pb pour assurer la spécificité, mais plus c'est long, mieux c'est, une amorce trop longue réduira également la spécificité et réduira le rendement.
2. Portée d'amplification de l'amorce : 200-500 pb est approprié, et le fragment peut être étendu à 10 kb dans des conditions spécifiques.
3. Base d'amorce : la teneur en G+C doit être de 40 à 60 %, trop peu d'effet d'amplification G+C n'est pas bon, trop de G+C est facile à faire apparaître des bandes non spécifiques.L'ATGC est mieux distribué au hasard, en évitant les grappes de plus de 5 nucléotides puriques ou pyrimidiques.Multi-GC pour l'extrémité 5' et les séquences intermédiaires pour augmenter la stabilité, éviter les GC riches à l'extrémité 3', pas de GC pour les 3 dernières bases, ou pas de GC pour 3 des 5 dernières bases.
4. Évitez la structure secondaire dans les amorces et évitez la complémentation entre deux amorces, en particulier la complémentation à l'extrémité 3 ', sinon un dimère d'amorce sera formé et des bandes amplifiées non spécifiques seront générées.
5. Les bases à l'extrémité 3 'des amorces, en particulier les dernières et avant-dernières bases, doivent être strictement appariées pour éviter l'échec de la PCR en raison de bases terminales non appariées.
6. Les amorces ont ou peuvent être ajoutées avec des sites de clivage appropriés, et la séquence cible amplifiée doit de préférence avoir des sites de clivage appropriés, ce qui est très bénéfique pour l'analyse de clivage ou le clonage moléculaire.
7. Spécificité des amorces : les amorces ne doivent avoir aucune homologie évidente avec d'autres séquences dans la base de données de séquences d'acides nucléiques.
8. Apprenez à utiliser les logiciels : PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (cette conception en ligne fonctionne mieux).
Le contenu ci-dessus peut résoudre au moins 99% des problèmes de conception d'amorce.
Contrôler les détails de la conception de l'apprêt
1. Longueur de l'amorce
La longueur générale de l'amorce est de 18 à 30 bases.En général, le facteur le plus important déterminant la température de recuit de l'amorce est la longueur de l'amorce.La température de recuit de l'amorce est généralement sélectionnée (valeur Tm -5℃), et certains utilisent directement la valeur Tm.Les formules suivantes peuvent être utilisées pour calculer approximativement la température de recuit des amorces.
Lorsque la longueur de l'amorce est inférieure à 20bp : [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
Lorsque la longueur de l'amorce est supérieure à 20bp : 62,3℃+0,41℃(%GC)-500/length-5℃
De plus, de nombreux logiciels peuvent également être utilisés pour calculer la température de recuit, le principe de calcul sera différent, donc parfois la valeur calculée peut avoir un petit écart.Pour optimiser les réactions PCR, les amorces les plus courtes qui garantissent des températures d'annelage d'au moins 54℃ sont utilisées pour la meilleure efficacité et spécificité.
Dans l'ensemble, la spécificité de l'amorce augmente d'un facteur quatre pour chaque nucléotide supplémentaire, de sorte que la longueur minimale de l'amorce pour la plupart des applications est de 18 nucléotides.La limite supérieure de la longueur de l'amorce n'est pas très importante, principalement liée à l'efficacité de la réaction.En raison de l'entropie, plus l'amorce est longue, plus la vitesse à laquelle elle s'hybride pour se lier à l'ADN cible est faible pour former une matrice double brin stable pour que l'ADN polymérase se lie.
Lors de l'utilisation d'un logiciel pour concevoir des amorces, la longueur des amorces peut être déterminée par la valeur TM à son tour, en particulier pour les amorces de PCR quantitative de fluorescence, TM = 60 ℃ ou plus doit être contrôlée.
Contenu 2.GC
En règle générale, la teneur en G + C dans les séquences d'amorces est de 40 % à 60 %, et la teneur en GC et la valeur Tm d'une paire d'amorces doivent être coordonnées.Si l'amorce a une forte tendance GC ou AT, une quantité appropriée de queue A, T ou G et C peut être ajoutée à l'extrémité 5' de l'amorce.
3. Température de recuit
La température de recuit doit être inférieure de 5 ℃ à la température de déchaînement.Si le nombre de bases d'amorces est petit, la température d'annelage peut être augmentée de manière appropriée, ce qui peut augmenter la spécificité de la PCR.Si le nombre de bases est grand, la température de recuit peut être réduite de manière appropriée.La différence de température de recuit entre une paire d'amorces de 4℃ ~ 6℃ n'affectera pas le rendement de la PCR, mais idéalement la température de recuit d'une paire d'amorces est la même, qui peut varier entre 55℃ ~ 75℃.
4. Évitez la zone de structure secondaire du modèle d'amplification
Il est préférable d'éviter la région de structure secondaire du modèle lors de la sélection du fragment amplifié.La structure secondaire stable du fragment cible peut être prédite et estimée par un logiciel informatique pertinent, ce qui est utile pour la sélection du modèle.Les résultats expérimentaux montrent que l'expansion échoue souvent lorsque l'énergie libre (△G) de la région à étendre est inférieure à 58,6lkJ/mol.
5. Incompatibilité avec l'ADN cible
Lorsque la séquence d'ADN cible amplifiée est grande, une amorce peut se lier à plusieurs parties de l'ADN cible, ce qui entraîne l'apparition de plusieurs bandes dans le résultat.Cette fois il faut utiliser le test du logiciel BLAST, site internet :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Sélectionnez Aligner deux séquences (bl2seq).
Le collage des séquences d'amorces dans la zone 1 et des séquences d'ADN cibles dans la zone 2 est interchangeable, et BLAST calcule les possibilités complémentaires, antisens et autres, de sorte que les utilisateurs n'ont pas besoin de remarquer si les deux chaînes sont des chaînes sens.Vous pouvez également entrer le numéro GI si vous connaissez le numéro GI de la séquence dans la base de données, de sorte que vous n'ayez pas à coller une grande partie de la séquence.Enfin, cliquez sur Aligner à 3 pour voir si l'amorce a plusieurs sites homologues dans l'ADN cible.
6. Borne d'amorçage
L'extrémité 3 'de l'amorce est l'endroit où l'extension commence, il est donc important d'empêcher les mésappariements de commencer là.L'extrémité 3' ne doit pas être supérieure à 3 G ou C consécutifs, car cela entraînerait le déclenchement par erreur de l'amorce dans la région de la séquence d'enrichissement G+C.L'extrémité 3' ne peut former aucune structure secondaire, sauf dans les réactions PCR spéciales (AS-PCR), l'extrémité 3' de l'amorce ne peut pas être désappariée.Par exemple, si la région codante est amplifiée, l'extrémité 3 'de l'amorce ne doit pas être terminée à la troisième position du codon, car la troisième position du codon est susceptible de dégénérer, ce qui affectera la spécificité et l'efficacité de l'amplification.Lors de l'utilisation d'amorces d'annexion, reportez-vous au tableau d'utilisation des codons, faites attention à la préférence biologique, n'utilisez pas d'amorces d'annexion à l'extrémité 3 'et utilisez une concentration plus élevée d'amorces (1uM-3uM).
7. Structure secondaire des amorces
Les amorces elles-mêmes ne doivent pas avoir de séquences complémentaires, sinon les amorces elles-mêmes se replieront en structures en épingle à cheveux, et cette structure secondaire affectera la liaison des amorces et des matrices en raison de l'encombrement stérique.Si un jugement artificiel est utilisé, les bases complémentaires continues des amorces elles-mêmes ne doivent pas être supérieures à 3 pb.Il ne doit pas y avoir de complémentarité entre les deux amorces, en particulier le chevauchement complémentaire de l'extrémité 3' doit être évité pour éviter la formation de dimères d'amorces.En général, il ne doit pas y avoir plus de 4 bases consécutives d'homologie ou de complémentarité entre une paire d'amorces.
8. Ajouter des marqueurs ou des lieux
L'extrémité 5' a peu d'effet sur la spécificité d'amplification et peut donc être modifiée sans affecter la spécificité d'amplification.La modification de l'extrémité 5' de l'amorce comprenait : l'ajout d'un site de restriction enzymatique ;Biotine marquée, fluorescence, digoxine, Eu3+, etc. Introduire des séquences d'ADN de liaison aux protéines ;Introduire des sites de mutation, insérer et manquer des séquences de mutation et introduire des séquences promotrices, etc. Les bases supplémentaires affecteront plus ou moins l'efficacité de l'amplification et augmenteront les chances de formation de dimères d'amorces, mais certaines concessions doivent être faites pour l'étape suivante.Des séquences supplémentaires qui n'existent pas sur la séquence cible, telles que des sites de restriction et des séquences promotrices, peuvent être ajoutées à l'extrémité 5' de l'amorce sans affecter la spécificité.Ces séquences ne sont pas incluses dans le calcul des valeurs de Tm des amorces, mais doivent être testées pour la complémentarité et la structure secondaire interne.
9. Sous-clones
La plupart du temps, la PCR n'est qu'un clonage préliminaire, puis nous devons sous-cloner le fragment cible dans divers vecteurs, nous devons donc concevoir des bases supplémentaires pour la prochaine opération de l'étape PCR.
Certaines séquences conçues pour le sous-clonage sont résumées ci-dessous.
Le site de restriction de l'endonucléase de restriction a été ajouté
L'ajout de sites de restriction enzymatique est la méthode la plus couramment utilisée pour sous-cloner les produits de PCR.Généralement, le site de clivage est de six bases, en plus de l'extrémité 5' du site de clivage il faut ajouter 2~3 bases protectrices.Cependant, le nombre de bases protectrices requises par différentes enzymes est différent.Par exemple, SalⅠ ne nécessite aucune base de protection, EcoRⅤ nécessite 1 base de protection, NotⅠ nécessite 2 bases de protection et Hind Ⅲ nécessite 3 bases de protection.
LIC ajoute la queue
Le nom complet de LIC est Ligation-Independent cloning, une méthode de clonage inventée par Navogen spécifiquement pour sa partie du vecteur pET.Le support pET préparé par la méthode LIC a des extrémités collantes monocaténaires non complémentaires de 12 à 15 bases, qui complètent les extrémités collantes correspondantes sur le fragment d'insert cible.A des fins d'amplification, la séquence 5' de l'amorce du fragment inséré doit compléter le vecteur LIC.L'activité d'extranect 3 '→ 5' de l'ADN polymérase T4 peut former une extrémité collante simple brin sur le fragment inséré après un court laps de temps.Parce que le produit ne peut être formé qu'à partir du recuit mutuel du fragment d'insert préparé et du vecteur, cette méthode est très rapide et efficace, et il s'agit d'un clonage dirigé.
Clone TA dirigé ajouter la queue
Le clonage TA n'a pas été en mesure de cibler le fragment dans un vecteur, donc plus tard, Invitrogen a introduit un vecteur qui pourrait cibler le clonage, qui contenait quatre GTGGS de base proéminents à une extrémité.Par conséquent, dans la conception des amorces de PCR, des séquences complémentaires doivent être ajoutées en conséquence, afin que les fragments puissent être « orientés ».
Si vous manquez de temps, vous pouvez essayer la synthèse directe, en combinant le gène avec le vecteur, ce que nous appelons la synthèse du gène ET chez les musécularistes.
D. Méthode de clonage In-Fusion
Aucune ligase requise, aucune longue réaction requise.Tant qu'une séquence aux deux extrémités du vecteur linéarisé est introduite dans la conception des amorces, puis le produit PCR et le vecteur linéarisé sont ajoutés dans la solution enzymatique en fusion contenant de la BSA et placés à température ambiante pendant une demi-heure, la transformation peut être effectuée.Cette méthode est particulièrement adaptée à la conversion de grands volumes.
10. Amorce de fusion
Parfois, seules des informations de séquence limitées sont connues sur la conception des amorces.Par exemple, si seule la séquence d'acides aminés est connue, l'amorce de fusion peut être conçue.Une amorce de fusion est un mélange de différentes séquences représentant toutes les différentes possibilités de bases qui codent pour un seul acide aminé.Pour augmenter la spécificité, vous pouvez vous référer au tableau d'utilisation des codons pour réduire l'annexion en fonction des préférences d'utilisation de base de différents organismes.L'hypoxanthine peut être associée à toutes les bases pour réduire la température de recuit de l'apprêt.Ne pas utiliser les bases annexées à l'extrémité 3' de l'amorce car l'hybridation des 3 dernières bases à l'extrémité 3' est suffisante pour initier la PCR au mauvais site.Des concentrations d'amorces plus élevées (1 μM à 3 μM) sont utilisées car les amorces dans de nombreux mélanges d'annexion ne sont pas spécifiques à la matrice cible.
Matières premières PCRcontrôle
1. Quantité d'apprêt
La concentration de chaque amorce est de 0,1 ~ 1 umol ou 10 ~ 100 pmol.Il est préférable de produire le résultat souhaité avec la plus faible quantité d'apprêt.Une concentration élevée d'amorce entraînera une incompatibilité et une amplification non spécifique, et augmentera le risque de formation de dimères entre les amorces.
2. Concentration d'apprêt
La concentration des amorces affecte la spécificité.La concentration optimale en amorce est généralement comprise entre 0,1 et 0,5 μM.Des concentrations d'amorces plus élevées conduisent à l'amplification de produits non spécifiques.
3. Température de recuit de l'amorce
Un autre paramètre important pour les amorces est la température de fusion (Tm).Il s'agit de la température à laquelle 50 % des amorces et des séquences complémentaires sont représentées sous forme de molécules d'ADN double brin.Tm est nécessaire pour régler la température de recuit PCR.Idéalement, la température de recuit est suffisamment basse pour assurer un recuit efficace des amorces avec la séquence cible, mais suffisamment élevée pour réduire la liaison non spécifique.Température de recuit raisonnable de 55℃ à 70℃.La température de recuit est généralement réglée à 5℃ inférieure à la Tm de l'amorce.
Il existe plusieurs formules de fixation de Tm, qui varient fortement selon la formule utilisée et la séquence des amorces.Étant donné que la plupart des formules fournissent une valeur Tm estimée, toutes les températures de recuit ne sont qu'un point de départ.La spécificité peut être améliorée en analysant plusieurs réactions qui augmentent progressivement la température de recuit.Commencez en dessous de la Tm-5℃ estimée et augmentez progressivement la température de recuit par incrément de 2℃.Une température de recuit plus élevée réduira la formation de dimères d'amorces et de produits non spécifiques.Pour de meilleurs résultats, les deux amorces doivent avoir des valeurs Tm approximatives.Si la différence de Tm des paires d'amorces est supérieure à 5℃, les amorces montreront un faux départ significatif en utilisant une température de recuit inférieure dans le cycle.Si les deux amorces Tm sont différentes, réglez la température de recuit à 5℃ inférieure à la Tm la plus basse.Alternativement, pour augmenter la spécificité, cinq cycles peuvent être effectués d'abord à des températures de recuit conçues pour une Tm plus élevée, suivies des cycles restants à des températures de recuit conçues pour une Tm plus basse.Cela permet d'obtenir une copie partielle du modèle de destination dans des conditions strictes.
4. Pureté et stabilité de l'amorce
La pureté standard des amorces personnalisées est adéquate pour la plupart des applications PCR.L'élimination des groupes benzoyle et isobutylyle par dessalage est minime et n'interfère donc pas avec la PCR.Certaines applications nécessitent une purification pour éliminer toutes les séquences non complètes dans le processus de synthèse.Ces séquences tronquées se produisent parce que l'efficacité de la chimie de synthèse de l'ADN n'est pas de 100 %.Il s'agit d'un processus circulaire qui utilise des réactions chimiques répétées lorsque chaque base est ajoutée pour fabriquer de l'ADN de 3 'à 5'.Vous pouvez échouer dans l'un ou l'autre cycle.Les amorces plus longues, en particulier celles de plus de 50 bases, ont une grande proportion de séquences tronquées et peuvent nécessiter une purification.
Le rendement des amorces est affecté par l'efficacité de la chimie de synthèse et de la méthode de purification.Les sociétés biopharmaceutiques, telles que Cytology et Shengong, utilisent toutes une unité DO minimale pour garantir la production totale d'oligonucléoside.Les apprêts personnalisés sont expédiés sous forme de poudre sèche.Il est préférable de redissoudre les amorces dans du TE pour que la concentration finale soit de 100μM.Le TE est meilleur que l'eau déminéralisée car le pH de l'eau est souvent acide et provoquera l'hydrolyse des oligonucléosides.
La stabilité des amorces dépend des conditions de stockage.La poudre sèche et les amorces dissoutes doivent être stockées à -20℃.Les amorces dissoutes dans TE à des concentrations supérieures à 10 μM peuvent être stockées de manière stable à -20 ℃ pendant 6 mois, mais ne peuvent être stockées qu'à température ambiante (15 ℃ à 30 ℃) pendant moins d'une semaine.Les apprêts en poudre sèche peuvent être conservés à -20 C pendant au moins 1 an et à température ambiante (15 C à 30 C) jusqu'à 2 mois.
5. Enzymes et leurs concentrations
À l'heure actuelle, l'ADN polymérase Taq utilisée est essentiellement l'enzyme de génie génétique synthétisée par les bactéries coliformes.La quantité d'enzyme nécessaire pour catalyser une réaction de PCR typique est d'environ 2,5 U (se réfère au volume de réaction total de 100 ul).Si la concentration est trop élevée, cela peut conduire à une amplification non spécifique ;si la concentration est trop faible, la quantité de produit de synthèse sera réduite.
6. Qualité et concentration de dNTP
La qualité du dNTP est étroitement liée à la concentration et à l'efficacité de l'amplification par PCR.La poudre de dNTP est granuleuse et sa variabilité perd son activité biologique si elle est mal conservée.La solution de dNTP est acide et doit être utilisée à haute concentration, avec une solution tampon NaOH 1M ou Tris.HCL 1M pour ajuster son pH à 7,0 ~ 7,5, petite quantité de sous-emballage, stockage congelé à -20℃.La congélation-décongélation multiple dégradera le dNTP.Dans la réaction PCR, le dNTP doit être de 50 ~ 200 umol/L.Surtout, il faut faire attention à ce que la concentration des quatre DNTPS soit égale (préparation à mole égale).Si la concentration de l'un d'entre eux est différente des autres (supérieure ou inférieure), une inadéquation sera causée.Une concentration trop faible réduira le rendement des produits PCR.Le dNTP peut se combiner avec le Mg2+ et réduire la concentration de Mg2+ libre.
7. Acide nucléique modèle (gène cible)
La quantité et le degré de purification de l'acide nucléique matrice sont l'un des maillons clés du succès ou de l'échec de la PCR.Les méthodes traditionnelles de purification de l'ADN utilisent généralement le SDS et la protéase K pour digérer et éliminer les échantillons.Les principales fonctions du SDS sont les suivantes : dissoudre les lipides et les protéines sur la membrane cellulaire, détruisant ainsi la membrane cellulaire en dissolvant les protéines membranaires, et dissocier les protéines nucléaires dans la cellule, le SDS peut également se combiner avec des protéines et précipiter ;La protéase K peut hydrolyser et digérer les protéines, en particulier les histones liées à l'ADN, puis utiliser du phénol et du chloroforme comme solvant organique pour extraire les protéines et d'autres composants cellulaires, et utiliser de l'éthanol ou de l'alcool isopropylique pour précipiter l'acide nucléique.L'acide nucléique extrait peut être utilisé comme matrice pour les réactions de PCR.Pour les échantillons de détection clinique générale, une méthode simple et rapide peut être utilisée pour dissoudre les cellules, lyser les agents pathogènes, digérer et éliminer les protéines des chromosomes pour libérer les gènes cibles, et directement utilisée pour l'amplification par PCR.L'extraction de la matrice d'ARN utilise généralement la méthode de l'isothiocyanate de guanidine ou de la protéase K pour empêcher la RNase de dégrader l'ARN.
8.Concentration de Mg2+
Mg2+ a un effet significatif sur la spécificité et le rendement de l'amplification par PCR.Dans la réaction PCR générale, lorsque la concentration de divers dNTP est de 200 umol/L, la concentration appropriée de Mg2+ est de 1,5 ~ 2,0 mmol/L.La concentration de Mg2+ est trop élevée, la spécificité de la réaction diminue, une amplification non spécifique se produit, une concentration trop faible réduira l'activité de l'ADN polymérase Taq, entraînant la réduction des produits de réaction.
Les ions magnésium affectent plusieurs aspects de la PCR, tels que l'activité de l'ADN polymérase, qui affecte le rendement ;Un autre exemple est le recuit d'amorce, qui affecte la spécificité.Le dNTP et la matrice se lient à l'ion magnésium, réduisant la quantité d'ion magnésium libre nécessaire à l'activité enzymatique.La concentration optimale en ions magnésium varie selon les paires d'amorces et les modèles, mais une concentration de départ PCR typique avec 200 μM de dNTP est de 1,5 mM (remarque : pour la PCR quantitative en temps réel, utilisez une solution d'ions magnésium de 3 à 5 mM avec une sonde fluorescente).Des concentrations plus élevées d'ions magnésium libres augmentent le rendement, mais augmentent également l'amplification non spécifique et diminuent la fidélité.Pour déterminer la concentration optimale, des titrages d'ions magnésium ont été effectués par incréments de 0,5 mM de 1 mM à 3 mM.Pour réduire la dépendance à l'optimisation des ions magnésium, l'ADN polymérase Platinum Taq peut être utilisée.L'ADN polymérase Platinum Taq est capable de maintenir sa fonction sur une plus large gamme de concentrations d'ions magnésium que l'ADN polymérase Taq et nécessite donc moins d'optimisation.
9. Additifs favorisant la PCR
L'optimisation de la température de recuit, de la conception des amorces et de la concentration en ions magnésium est suffisante pour une amplification hautement spécifique de la plupart des modèles ;cependant, certains modèles, y compris ceux à forte teneur en GC, nécessitent des mesures supplémentaires.Les additifs qui affectent la température de fusion de l'ADN offrent un autre moyen d'améliorer la spécificité et le rendement du produit.Une dénaturation complète du modèle est nécessaire pour de meilleurs résultats.
De plus, la structure secondaire empêche la liaison des amorces et l'extension enzymatique.
Les additifs PCR, y compris le formamide, le DMSO, la glycérine, la bétaïne et la PCRx Enhancer Solution, améliorent l'amplification.Leur mécanisme possible est de réduire la température de fusion, facilitant ainsi l'annelage des amorces et aidant l'extension de l'ADN polymérase à travers la région de structure secondaire.La solution PCRx présente d'autres avantages.Une optimisation minimale des ions magnésium est requise lorsqu'elle est utilisée avec l'ADN polymérase Platinum Taq et l'ADN polymérase Platinum Pfx.Ainsi, la technique Platinum est combinée avec l'additif pour augmenter la spécificité tout en réduisant la dépendance de la troisième approche, l'optimisation des ions magnésium.Pour de meilleurs résultats, la concentration des additifs doit être optimisée, en particulier le DMSO, le formamide et le glycérol, qui inhibent l'ADN polymérase Taq.
10. Démarrage à chaud
La PCR à démarrage à chaud est l'une des méthodes les plus importantes pour améliorer la spécificité de la PCR en plus d'une bonne conception des amorces.Bien que la température d'élongation optimale de l'ADN polymérase Taq soit de 72℃, la polymérase reste active à température ambiante.Ainsi, des produits non spécifiques sont produits lorsque la température de maintien est inférieure à la température d'hybridation lors de la préparation de la réaction PCR et au début du cycle thermique.Une fois formés, ces produits non spécifiques sont efficacement amplifiés.La PCR à démarrage à chaud est particulièrement efficace lorsque les sites utilisés pour la conception des amorces sont limités par l'emplacement des éléments génétiques, tels que les mutations dirigées, le clonage d'expression ou la construction et la manipulation d'éléments génétiques utilisés pour l'ingénierie de l'ADN.
Une méthode courante pour limiter l'activité de l'ADN polymérase Taq consiste à préparer une solution de réaction PCR sur de la glace et à la placer dans un appareil PCR préchauffé.Cette méthode est simple et peu coûteuse, mais elle ne complète pas l'activité de l'enzyme et donc n'élimine pas complètement l'amplification de produits non spécifiques.
L'amorçage thermique retarde la synthèse d'ADN en inhibant un composant essentiel jusqu'à ce que l'appareil PCR atteigne la température de dénaturation.La plupart des méthodes manuelles d'initiation thermique, y compris l'ajout différé d'ADN polymérase Taq, sont fastidieuses, en particulier pour les applications à haut débit.D'autres méthodes d'amorçage thermique utilisent un écran de cire pour enfermer un composant essentiel, y compris des ions magnésium ou des enzymes, ou pour isoler physiquement des composants réactifs, tels que des modèles et des tampons.Au cours du cycle thermique, les différents composants sont libérés et mélangés au fur et à mesure que la cire fond.Comme la méthode de démarrage manuel à chaud, la méthode du pare-cérumen est lourde et sujette à la contamination et ne convient pas aux applications à haut débit.
L'ADN polymérase de platine est pratique et efficace pour la PCR automatique à démarrage à chaud.L'ADN polymérase Platinum Taq consiste en une ADN polymérase Taq recombinante combinée à un anticorps monoclonal dirigé contre l'ADN polymérase Taq.Les anticorps sont formulés par PCR pour inhiber l'activité enzymatique lors d'un maintien prolongé de la température.L'ADN polymérase Taq a été libérée dans la réaction au cours de l'isolement à 94 °C de l'étape de dénaturation, rétablissant l'activité complète de la polymérase.Contrairement à l'ADN polymérase Taq modifiée chimiquement pour l'initiation thermique, l'enzyme Platinum ne nécessite pas d'isolation prolongée à 94℃ (10 à 15 minutes) pour activer la polymérase.Avec l'ADN polymérase PlatinumTaq, 90% de l'activité de l'ADN polymérase Taq a été restaurée après 2 minutes à 94 ℃.
11. Nest-PCR
Des cycles successifs d'amplification utilisant des amorces imbriquées peuvent améliorer la spécificité et la sensibilité.Le premier tour est une amplification standard de 15 à 20 cycles.Une petite fraction du produit d'amplification initial a été diluée 100 à 1000 fois et ajoutée au deuxième cycle d'amplification pendant 15 à 20 cycles.En variante, le produit initial amplifié peut être calibré par purification sur gel.Une amorce imbriquée est utilisée dans le deuxième cycle d'amplification, qui peut se lier à la séquence cible à l'intérieur de la première amorce.L'utilisation de la PCR nichée réduit la possibilité d'amplification de plusieurs sites cibles car il existe peu de séquences cibles complémentaires aux deux ensembles d'amorces.Le même nombre total de cycles (30 à 40) avec les mêmes amorces amplifiait les sites non spécifiques.La PCR nichée augmente la sensibilité de séquences cibles limitées (par exemple, les ARNm rares) et améliore la spécificité des PCRS difficiles (par exemple, 5′ RACE).
12. PCR descendant
La PCR descendante améliore la spécificité en utilisant des conditions d'annelage serrées pour les premiers cycles de PCR.Le cycle commence à une température de recuit environ 5℃ supérieure à la Tm estimée, puis chaque cycle est réduit de 1℃ à 2℃ jusqu'à ce que la température de recuit soit inférieure à Tm 5℃.Seul le modèle de destination avec la plus grande homologie sera amplifié.Ces produits continuent à se développer dans les cycles suivants, évinçant les produits non spécifiques amplifiés.La PCR descendante est utile pour les méthodes où le degré d'homologie entre l'amorce et la matrice cible n'est pas connu, comme l'empreinte ADN AFLP.
Kits PCR associés
Le 2 × PCR HeroTMLe système Mix a une plus grande tolérance aux inhibiteurs de PCR que le système PCR Mix ordinaire et peut facilement faire face à l'amplification PCR de diverses matrices complexes.Le système de réaction unique et le Taq Hero à haute efficacité confèrent à la réaction PCR une efficacité, une spécificité et une sensibilité d'amplification supérieures.
Efficacité d'amplification supérieure
Il a une activité 5'→3' ADN polymérase et une activité 5'→3' exonucléase, sans activité 3'→5' exonucléase.
Kit PCR en temps réel Easyᵀᴹ-SYBR Green I
Spécifique—le tampon optimisé et l'enzyme Taq à démarrage à chaud peuvent empêcher l'amplification non spécifique et la formation de dimères d'amorces
Haute sensibilité - peut détecter les copies faibles du modèle
Le kit utilise un réactif de transcription inverse Foregene unique et l'ADN polymérase Foregene HotStar Taq combinés à un système de réaction unique pour améliorer efficacement l'efficacité de l'amplification et la spécificité de la réaction.
Heure de publication : 09-mai-2023
