Je crois que tout le monde rencontrera toujours tel ou tel problème en faisant des réactions PCR, mais la plupart d'entre eux peuvent être classés en deux problèmes principaux :

Trop peu d'amplification de la matrice du gène (amplification) ;
Trop d'amplification de gène non cible.
L'utilisation d'additifs est l'une des stratégies courantes pour résoudre ces problèmes.Habituellement, le rôle des additifs a deux aspects :
structure secondairede gènes (structure secondaire) ;
Réduire l'amorçage non spécifique.
Aujourd'hui, l'éditeur vous présentera brièvement les additifs courants dans les réactions PCR et leurs fonctions.
Additifs qui réduisent la structure secondaire
sulfoxyde(DMSO)
échantillons de gènesà haute teneur en GC.Cependant, le DMSO réduit également considérablement l'activité de la polymérase Taq.Par conséquent, chacun doit équilibrer l'accessibilité de la matrice et l'activité de la polymérase.L'éditeur suggère que vous pouvez essayer différentes concentrations de DSMO, telles que de 2 % à 10 %, pour trouver la concentration qui convient à votre expérience.
Détergents non ioniques
Les détergents non ioniques, tels que le Triton X-100 à 0,1-1 %, le Tween 20 ou le NP-40, réduisent généralement la structure secondaire de l'ADN.Bien que cela puisse augmenter l'amplification du gène matrice, cela causera également le problème d'une amplification non spécifique.Ainsi, ces additifs fonctionnent bien pour les réactions PCR à faible rendement sans débris, mais pas aussi bien pour les réactions PRC relativement impures.Un autre avantage des détergents non ioniques est la réduction de la contamination par le SDS.Habituellement, lors du processus d'extraction de l'ADN, le SDS sera amené à l'étape de PCR, ce qui inhibe fortement l'activité de la polymérase.Par conséquent, l'ajout de 0,5 % de Tween-20 ou de Tween-40 à la réaction peut neutraliser les effets négatifs du SDS.
Bétaïne_
La bétaïne peut améliorer l'amplification de l'ADN en réduisant la formation de structures secondaires et est généralement un ajout « mystérieux » aux kits de PCR commerciaux.Si vous souhaitez utiliser de la bétaïne, vous devez mettre de la bétaïne ou du monohydrate de bétaïne (bétaïne ou monohydrate de bétaïne), mais pas de chlorhydrate de bétaïne (bétaïne HCl), ajuster à une concentration finale de 1-1,7 M.La bétaïne peut également aider à améliorer la spécificité car elle élimine la dépendance à la composition des paires de bases de la fusion de l'ADN/de la dénaturation de l'ADN.
Additifs pour réduire l'amorçage non spécifique
Formamide
Le formamide est un additif PCR organique couramment utilisé.Il peut se combiner avec le sillon majeur et le sillon mineur de l'ADN, réduisant ainsi la stabilité de la double hélice de l'ADN maître et abaissant la température de fusion de l'ADN.La concentration de formamide utilisée dans les expériences de PCR est généralement de 1 % à 5 %.
Tétraméthylechlorure d'ammonium( TMAC)
Le chlorure de tétraméthylammonium peut augmenter la spécificité de l'hybridation (spécificité d'hybridation) et augmenter la température de fusion de l'ADN.Ainsi, TMAC peut supprimer l'amorçage non spécifique et réduire la mauvaise liaison de l'ADN et de l'ARN.Si tu utilisesamorces dégénéréesdans la réaction PCR, n'oubliez pas d'ajouter du TMAC, qui est couramment utilisé à une concentration de 15-100 mM.
Autres additifs courants
En plus des deux catégories d'additifs mentionnés ci-dessus, il existe de nombreux additifs communs dans les réactions de PCR, bien qu'ils aient des fonctions différentes, ils sont également très importants.
Ion magnésium
L'ion magnésium est un cofacteur indispensable (cofacteur) de la polymérase, c'est-à-dire que sans ion magnésium, la polymérase est inactive.Cependant, trop d'ions magnésium peuvent également affecter l'efficacité de la polymérase.La concentration d'ions magnésium dans chaque réaction de PCR variera.Les agents chélateurs (tels que l'EDTA ou le citrate), la concentration de dNTP et de protéines affectent tous la concentration d'ions magnésium.Ainsi, si vous rencontrez des problèmes avec votre expérience PCR, vous pouvez essayer de modifier différentes concentrations d'ions magnésium, par exemple, de 1,0 à 4,0 mM, avec un intervalle de 0,5 à 1 mM entre les deux.
Il convient de noter que plusieurs cycles de congélation-décongélation peuvent entraîner une stratification de la concentration de la solution de chlorure de magnésium .Par conséquent, vous devez le dissoudre complètement avant chaque utilisation et bien le mélanger avant de l'utiliser.
Albumine de sérum bovin(Albumine bovine, BSA)
Dans les expériences de chimie moléculaire, l'albumine sérique bovine est un additif très courant, en particulier dans les expériences de digestion par des enzymes de restriction et de PCR.Dans les réactions PCR, la BSA est utile pour réduire les contaminants tels que les composés phénoliques .Et on dit aussi qu'il peut réduire l'adhérence des réactifs à la paroi du tube à essai.Dans la réaction PCR, la concentration de BSA ajoutée peut généralement atteindre 0,8 mg/ml.
 
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