Auteurs : Wang Xiaoyan, Zhao Eryu

Unité : Hôpital de Jiaozhou, Hôpital de Dongfang affilié à l'Université de Tongji

À l'heure actuelle, le principal type d'échantillon pour la détection des acides nucléiques pathogènes respiratoires est le prélèvement de gorge.Il existe de nombreux types de solutions de conservation d'échantillons couramment utilisées, qui doivent toutes être réfrigérées ou congelées pour le transport et le stockage ;Il est difficile de contrôler l'ensemble du processus de basse température pendant le processus de collecte et de transport, et il est difficile d'assurer le contrôle de la qualité avant les tests d'échantillons^[1-2].

La RNase (RNase) est une endonucléase qui hydrolyse l'ARN, rompant principalement les liaisons phosphodiester entre les nucléotides.La molécule de RNase est très stable, il y a des liaisons disulfure dans la structure et son activité ne nécessite pas la présence de cations divalents, de sorte que la RNase n'est pas facilement dénaturée et qu'il est facile de la renaturer même après une température élevée ou l'utilisation de dénaturants.Les RNases sont divisées en endogènes et exogènes.Les RNases endogènes peuvent être libérées en même temps que les cellules se rompent.Par conséquent, l'élimination du rôle des RNases endogènes est une étape très critique dans le processus d'extraction d'ARN.Les RNases exogènes sont largement distribuées.Les RNases existent dans l'air, la peau humaine, les cheveux et la salive, qui sont des raisons importantes pour la dégradation facile de l'ARN^[3].

Requête de données

CANS-CL02-A009 « Application des lignes directrices sur la qualité et l'accréditation des laboratoires médicaux dans le domaine du diagnostic moléculaire » dans les exigences techniques propose que des normes de qualité de l'eau appropriées soient formulées en fonction de l'application ;Contenants hermétiques jetables :

RNase/Classification

(1) RNase A

La ribonucléase A (RNase A), dérivée du pancréas bovin, est une endoribonucléase qui peut attaquer spécifiquement l'extrémité 3 'des résidus pyrimidine sur l'ARN, coupant la cytosine ou l'uracile formée par les nucléotides adjacents.Liaison phosphodiester, le produit final de la réaction est un nucléotide 3 'pyrimidine et un oligonucléotide avec un nucléotide 3' pyrimidine à la fin.

(2) RNase T1

La ribonucléase T1 (RNase T1) est dérivée d'Aspergillus orjzae, elle agit spécifiquement sur le phosphate 3'-terminal de la guanine, et le site de clivage se situe entre le phosphate 3' de la guanine et l'hydroxyle 5' des nucléotides adjacents.Le produit final de la réaction est l'acide 3'guanylique et des fragments d'oligonucléotides avec l'acide 3'guanylique à la fin.

(3) RNase H

La ribonucléase H (RNase H) a été découverte pour la première fois à partir de tissu de thymus de veau et son gène codant a été cloné dans Escherichia coli.Il peut spécifiquement dégrader l'ADN: brins d'ARN dans les duplex hybrides d'ARN, résultant en des oligonucléotides et des mononucléotides avec des extrémités 3′-OH et 5′-monophosphate, il ne peut pas dégrader l'ADN ou l'ARN simple ou double brin.

RNase

Fonction et utilisation

La ribonucléase peut catalyser la dégradation de l'acide ribonucléique (ARN) et peut être synthétisée artificiellement.La pommade médicinale est utilisée par voie topique pour traiter les traumatismes et les douleurs articulaires.Selon des rapports, la ribonucléase peut modifier le métabolisme de la cellule hôte, inhiber la synthèse du virus, inhiber la prolifération du virus de la grippe in vitro et inhiber la formation du virus de la vaccine et de l'herpès dans les embryons de poulet.Utilisation clinique de la ribonucléase par injection intramusculaire quotidienne de 180 mg, bénéfique dans le traitement de l'encéphalite épidémique, la ribonucléase peut catalyser la dégradation de l'acide ribonucléique (ARN), et peut maintenant être synthétisée artificiellement.La pommade médicinale est utilisée par voie topique pour traiter les traumatismes et les douleurs articulaires.Selon des rapports, la ribonucléase peut modifier le métabolisme de la cellule hôte, inhiber la synthèse du virus, inhiber la prolifération du virus de la grippe in vitro et inhiber la formation du virus de la vaccine et de l'herpès dans les embryons de poulet.L'utilisation clinique de l'injection intramusculaire quotidienne de ribonucléase de 180 mg est bénéfique pour le traitement de l'encéphalite épidémique.

RNase

Définition de l'inhibiteur

Définition de l'unité d'inhibiteur de RNase : La quantité d'enzyme nécessaire pour inhiber 50 % de l'activité de 5 ng de RNase A est d'une unité.

Comment fonctionnent les inhibiteurs de RNase

Isothiocyanate de guanidine :

L'isothiocyanate de guanidine est un composé organique de formule moléculaire C2H6N4S.Principalement utilisé en médecine biologique, réactifs chimiques, etc. L'isothiocyanate de guanidine est un agent de lyse des protéines, et il est souvent utilisé comme composant principal de la solution de lyse dans les réactifs de diagnostic moléculaire.Il peut lyser les tissus, détruire la structure cellulaire et dissocier l'acide nucléique de la nucléoprotéine, et a une forte dénaturation en RNase.C'est l'inhibiteur de RNase le plus efficace à l'heure actuelle.

TRIzol est un nouveau réactif d'extraction d'ARN total qui peut extraire directement l'ARN total des cellules ou des tissus.Il contient des substances telles que le phénol et l'isothiocyanate de guanidine, qui peuvent rapidement perturber les cellules et inhiber les nucléases libérées par les cellules.

(Cependant, l'isothiocyanate de guanidine est dangereux pour la santé des chercheurs de laboratoire.)

RNasine :

Glycoprotéine acide extraite du foie de rat ou du blastoderme humain.La Rnasine est un inhibiteur non compétitif de la RNase, qui peut se lier à diverses RNases pour les inactiver.

(Plus de détails : https://www.foreivd.com/foreasy-rnase-inhibitor-product/)

Hhaute température :

La température élevée est également un moyen courant de dénaturation des protéines.

Pyrocarbonate de diéthyle (DEPC) :

Le DEPC est un inhibiteur puissant mais incomplet de la RNase, qui peut inhiber l'activité de la RNase en se combinant avec le cycle imidazole des acides aminés du groupe actif de la RNase pour dénaturer les protéines.

Complexe vanadyle ribonucléoside :

Complexe formé d'ions d'oxyde de vanadium et de nucléosides, qui se lie à la RNase sous forme de substances de transition, qui peuvent inhiber presque complètement l'activité de la RNase

autre:

Le SDS, l'urée, la terre de diatomées, etc. ont également un certain effet inhibiteur sur la RNase.

Avis d'experts

Li Yujie Technicien en chef

Directeur du département de laboratoire, hôpital de Jiaozhou, hôpital de Dongfang affilié à l'université de Tongji

Afin d'empêcher la biodégradation de la RNase exogène, des masques, des gants et des chapeaux doivent être portés et remplacés fréquemment pendant le processus d'extraction de l'ARN.Toute verrerie doit être cuite dans une étuve à 200°C pendant plus de 2 heures.Les matériaux utilisés pour la cuisson, tels que le plastique, doivent être traités avec de l'eau DEPC, puis lavés avec de l'eau distillée.Les réactifs ou dispositifs utilisés pour l'extraction, la conservation et l'identification de l'ARN doivent être dédiés à l'ARN, et une zone d'opération ARN indépendante doit être mise en place.

les références:

[1] Smith-Vaughan HC, Binks MJ, Beissbarth J, et al.Bactéries et virus dans le nasopharynx immédiatement avant l'apparition d'infections aiguës des voies respiratoires inférieures chez les enfants indigènes australiens [J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2018,37 (9): 1785-1794.

[2] Branche de contrôle des infections hospitalières de l'Association chinoise de médecine préventive.Lignes directrices pour la collecte et l'inspection des échantillons cliniques microbiens [J].Journal chinois des infections hospitalières, 2018(20):3192-3200.

[3] "Test clinique dix mille pourquoi volume de test de biologie moléculaire"