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Les transcriptases inverses traditionnelles ne peuvent pas tolérer des températures élevées (la température optimale pour l'activité MMLV est de 37-50°C, et l'AMV est de 42-60°C).L'ARN viral plus complexe ne peut pas être transcrit efficacement en ADNc à basse température, ce qui entraîne une réduction de l'efficacité de détection.La RT-qPCR traditionnelle nécessite généralement la participation de deux enzymes clés (transcriptase inverse et ADN polymérase), ce qui rend impossible la simplification du fonctionnement du système réactionnel et la réduction du coût.Ici, nous allons introduire deux transcriptases inverses résistantes aux hautes températures, TtH et RevTaq.Ces deux enzymes ont également la fonction d'ADN polymérase, elles sont donc appelées enzymes bifonctionnelles.

ADN polymérase TtH

Vous devez avoir entendu parler de TtH, qui est dérivé de la bactérie thermophile Thermus thermophilus HB8.En présence de cations divalents tels que Mg2+, il possède une activité ADN polymérase.Il est largement utilisé dans les réactions PCR comme l'enzyme Taq, mais il a une résistance à la chaleur plus élevée que l'enzyme Taq, il a donc également un meilleur effet sur la PCR avec des modèles à haute teneur en GC.

· Cette enzyme n'a fondamentalement pas d'activité exonucléase 3′→5′ et d'activité exonucléase 5′→3′, elle peut donc également être utilisée pour le séquençage didésoxy.

· Cette enzyme a une activité RTase.En présence de Mn2+, l'activité RTase sera renforcée.En utilisant cette fonctionnalité, il peut être utilisé pour effectuer une réaction de transcription inverse et une réaction PCR dans le même tube, c'est-à-dire une RT-PCR en une étape.Cependant, en présence de Mn2+, la précision de la RT-PCR n'est pas élevée.L'activité RT n'a rien à voir avec l'activité rnaase H.

· L'activité accrue de la Tth-ADN polymérase (pH9, optimum +55℃~+70℃, maximum +95℃) surmonte les problèmes causés par la structure secondaire de l'ARN.L'ADNc résultant peut être amplifié par PCR avec la même enzyme en présence d'ions Mg2+.

· La capacité de la Tth-ADN polymérase à effectuer une transcription inverse et une amplification de l'ADN à des températures élevées rend cette enzyme utile pour la RT-PCR quantitative, le clonage et l'analyse de l'expression génique de l'ARN cellulaire et viral.
· La Tth-ADN polymérase est utilisée pour la RT-PCR pour amplifier l'ARN jusqu'à 1kb.

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Caractéristiques et avantages

Tth ADN polymérase :

• Assurez-vous que la taille du produit de réaction en chaîne par polymérase (PCR) est optimisée, au moins 1 000 pb dans la réaction RT-PCR

• Accepter le désoxyribonucléoside triphosphate modifié comme substrat

• Non lié à l'activité RNase H

• A une stabilité thermique élevée pour surmonter les problèmes, généralement liés à la structure secondaire élevée présente dans l'ARN

RevTaq RT‐PCR ADN polymérase

Une ADN polymérase résistante à la chaleur avec une activité transcriptase inverse

RevTaq-RT-PCR-DNA polymérase est une enzyme bifonctionnelle hautement résistante à la chaleur, dotée d'activités de transcriptase inverse et d'ADN polymérase obtenue par évolution dirigée et artificielle.

· La demi-vie de l'ADN polymérase RevTaq RT-PCR à 95°C est supérieure à 40 minutes.

· L'ADN polymérase RevTaq RT-PCR permet une transcription inverse à haute température directement à partir de la matrice d'ARN, et l'étape de transcription inverse peut être répétée plusieurs fois pour générer davantage de matrices d'ADNc.

· L'ADN polymérase RevTaq RT-PCR permet une RT-PCR "zero-step" (pas d'étape de transcription inverse isotherme), car dans l'étape d'extension PCR cyclique, la transcription inverse et l'amplification de l'ADN se produisent simultanément.Cela favorise également la réaction de transcription inverse à des températures élevées, minimisant ainsi les problèmes rencontrés lors de la fusion de la structure secondaire forte dans l'ARN à des températures élevées.

· En raison de la formule de démarrage à chaud à base d'aptamères, l'ADN polymérase RevTaq RT-PCR produira de meilleurs résultats lorsque la température d'hybridation et d'extension est supérieure à 57°C.

· L'enzyme étant résistante à la chaleur, il est recommandé de concevoir des amorces et des sondes à très haut point de fusion (>60°C).

· Il est recommandé d'optimiser la température de l'étape de recuit/extension à travers un gradient de température pendant le processus de préparation de la réaction.

· Plus la température est élevée, plus la spécificité de la PCR est élevée.Le cycle de transcription inverse est généralement effectué à une température plus élevée que le cycle de PCR, car l'hybridation amorce ADN: matrice d'ARN a généralement un point de fusion plus élevé que le duplex amorce ADN: matrice d'ADNc.

· L'ADN polymérase RevTaq RT-PCR est génétiquement modifiée et optimisée, et la taille de l'amplicon est comprise entre 60 et 300 bp.

La limite de détection de l'ADN polymérase RevTaq RT-PCR atteint 4 copies/Deux (2)

Le système de réaction optimisé (l'établissement d'amorces à haut point de fusion) est représenté sur la figure.RevTaq RT-PCR La RT-PCR pilotée par l'ADN polymérase présente une meilleure sensibilité que le mélange maître RT-qPCR en 1 étape TaqPath et une détection plus faible du gradient de dilution de l'échantillon.

Plus d'avantages :

Fonction de démarrage rapide → L'étape initiale de dénaturation thermique peut être ignorée.

Formule d'aptamère à démarrage à chaud → Fournit immédiatement une activité enzymatique à 100 % et empêche l'amplification non spécifique à basse température (<57°C).

Fonction de clivage → L'étape d'extraction de l'ARN est omise, car l'ADN polymérase RevTaq RT-PCR peut également traiter des échantillons de réaction bruts.Il peut immédiatement détruire les membranes cellulaires des eucaryotes, des bactéries et des virus dans un cycle de RT-PCR à chaud.

Niveau de matière première IVD → normes de qualité élevées et prix extrêmement compétitifs


Heure de publication : 12 août 2021