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Conseils pour améliorer la récupération de colle

1. Augmentez la charge d'échantillon pendant l'électrophorèse.

2. Utilisez un tampon d'électrophorèse fraîchement préparé.

3. Lors de la coupe de la colle, essayez de couper uniquement la colle avec des bandes pour réduire le volume de coupe de la colle : vous n'avez pas besoin de colle avec peu de fragments, sinon cela affectera le taux de récupération.

4. Après avoir fait fondre deux morceaux de colle ou plus, utilisez un tube, quel que soit le volume, et transférez-le dans la même colonne.

5. La solution ajoutée dans le sol peut être un peu plus, ce qui est plus propice à la liaison de l'ADN à la membrane, mais ne dépasse généralement pas 750ul.

6. La clé de la récupération du gel consiste à lier l'ADN à la colonne via la concentration en sel, l'acidité (charge) et l'hydrophobicité de la solution dans la colonne.Par conséquent, si le pH du tampon d'électrophorèse est trop élevé, 10 ul (pH 5,0, 3mol/L NaAC) peuvent être ajoutés au sol ;afin de mieux intercepter les molécules d'ADN sur la membrane, 30% d'isopropanol peut être ajouté pour chauffer le liquide après dissolution de la colle.

7. Avant d'ajouter l'éluant, laisser la colonne à température ambiante pendant quelques minutes (environ 10 minutes) pour évaporer complètement l'éthanol.

8. Enfin, ajoutez moins d'éluant pour minimiser le volume de récupération.Généralement, 30-50μl d'éluant sont utilisés pour l'élution (pas trop peu, sinon il ne pourra pas mouiller la membrane, ce qui n'est pas propice à l'élution) ;les gouttelettes d'élution sont au centre de la membrane, pour éluer complètement l'ADN lié à la membrane.

9. Après avoir ajouté l'éluant, il peut être élué dans un bain-marie à 55 degrés pendant 5 minutes ou placé dans un bain-marie à 50 degrés pendant plus de 10 minutes, ou scellé avec un parafilm à 4 degrés pendant la nuit, puis centrifugé pour récupération le lendemain, l'effet est bon.

10.Remettre l'éluat centrifugé dans la colonne d'adsorption et centrifuger à nouveau.

photo8

Méthodes et procédures détaillées pour la récupération des produits PCR

1. Recyclage du caoutchouc ordinaire

Si vous souhaitez récupérer la colle, il est préférable d'utiliser un kit, qui est pratique et a un taux de récupération un peu plus élevé.Si vous avez vraiment besoin de le récupérer manuellement, vous pouvez ajouter 3 fois le volume de TE après avoir coupé la colle.Après fusion au bain-marie, le phénol, le phénol/chloroforme sont extraits proprement et l'éthanol est précipité.C'est ça.

2. Récupération d'ADN à partir de gels à bas point de fusion

Purification des fragments d'ADN Ajouter du TE (10 mmol/l Tris-HCl pH 8,0, 0,1 mmol/l EDTA) égal au volume du gel et placer dans un bain-marie à 65°C pendant 5 minutes pour dissoudre complètement le gel.

Après avoir été ramené à température ambiante, une quantité égale de phénol (saturé de TE, le TE a été scellé dans la couche supérieure et la couche inférieure de phénol a été retirée) a été ajoutée, et le mélange a été doucement mélangé (aucun mélange requis) et centrifugé à 12 000 tr/min pendant 3 minutes.Répétez 1-2 fois.

Prendre le surnageant, ajouter 0,1 volume d'acétate de sodium 3mol/L (pH 5,2) et 2,5 fois volume d'éthanol absolu pour effectuer la précipitation à l'éthanol.Dissolvez l'ADN purifié avec une quantité appropriée de TE, mesurez le contenu et préparez-le pour l'utilisation (il peut être utilisé pour l'analyse de la structure du gène cible, la préparation de la sonde, etc.).

3. Récupération PCR avec une bonne spécificité d'amplification

Si la spécificité de l'amplification PCR est bonne, il ne s'agit que d'une simple purification et récupération du produit PCR.Vous pouvez ajouter 50 ug/ml de protéinase K au produit PCR, 37 degrés pendant 1 h, extraire une fois avec du phénol/chloroforme, extraire une fois avec du chloroforme et ajouter 0,1 volume de surnageant.L'acétate de sodium est récupéré par précipitation avec 2,5 volumes d'éthanol absolu.

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Heure de publication : 24 septembre 2022