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Récemment, j'ai découvert quelque chose d'incroyable !De nombreux professionnels de l'expérimentation avancés autour de lui ne connaissent même pas certains points de connaissances expérimentales très basiques.

Par exemple, pouvez-vous répondre aux questions suivantes ?

Y a-t-il une différence entre OD260 et A260 ?Que signifie chacun ?
OD est l'abréviation de densité optique (densité optique), A est l'abréviation d'absorbance (absorbance), les deux concepts sont en fait les mêmes, "densité optique" est "absorbance", mais la "densité optique" est conforme à la plupart des normes nationales et plus standardisée.

Habituellement, nous mesurons la valeur OD à 260 nm pour calculer la concentration d'acide nucléique, alors que représente 1OD ?
L'acide nucléique a un pic d'absorption maximum à une longueur d'onde de 260 nm, qui contient à la fois de l'ADN et de l'ARN, ainsi que des fragments d'acide nucléique fragmentés (c'est le point clé).
La valeur OD mesurée à une longueur d'onde de 260 nm a été enregistrée comme OD260.Si l'échantillon est pur, la valeur OD260 peut calculer la concentration de l'échantillon d'acide nucléique.
1 DO260=50 μg/ml ADNdb (ADN double brin)
=37 μg/ml ADNss (ADN simple brin)
=40 μg/ml d'ARN
=30 μg/ml dNTP (oligonucléotides)
Existe-t-il un lien et une différence entre RT-PCR, Realtime-PCR et QPCR ?
RT-PCR est l'abréviation de Reverse Transcription PCR
PCR en temps réel = qPCR, abréviation de PCR quantitative en temps réel
Bien que la PCR en temps réel (PCR quantitative fluorescente en temps réel) et la PCR à transcription inverse (PCR à transcription inverse) semblent toutes deux être abrégées en RT-PCR.Mais la convention internationale est la suivante : RT-PCR fait spécifiquement référence à la PCR à transcription inverse.

Quels sont les nt, bp et kb couramment utilisés pour décrire la longueur de l'ADN/ARN en biologie ?
nt = nucléotide
bp = paire de bases paire de bases
kb = kilobase

Bien sûr, vous diriez que beaucoup de gens ne se soucient pas de ces petits détails !Tout le monde le fait, et personne ne vous demandera ce que c'est.Vous savez que c'est inutile, n'est-ce pas ?

Non, Non, Non, il faut bien le savoir !à cause de quoi ?
Parce que vous voulez publier un article !Frère!Que vous visiez l'obtention d'un diplôme ou que vous poursuiviez des réalisations de recherche scientifique, vous devez vous fier aux articles pour parler !

L'extraction d'acide nucléique devrait être l'expérience la plus simple et la plus élémentaire.La qualité de l'extraction des acides nucléiques détermine directement les résultats des expériences ultérieures.

Bien que je l'aie dit plusieurs fois, il y a encore beaucoup d'amis qui s'en fichent.Cette fois, j'ai décidé de sortir de l'article!

image1
Informations minimales pour la publication d'expériences quantitatives de PCR en temps réel, appelées MIQE, est un ensemble de lignes directrices sur les expériences quantitatives de fluorescence lancées à l'échelle internationale, qui propose des normes minimales pour les informations expérimentales nécessaires à l'évaluation des expériences de PCR quantitative de fluorescence et à la publication d'articles.Grâce aux conditions expérimentales et aux méthodes d'analyse fournies par l'expérimentateur, les examinateurs peuvent mieux évaluer la validité du schéma expérimental du chercheur.
image2
On peut voir que dans la section d'extraction d'acide nucléique, les éléments de détection suivants ont été proposés,

« E » indique les informations qui doivent être fournies et « D » indique les informations qui doivent être fournies si nécessaire.

Le formulaire est très compliqué, en fait, je veux dire que tout le monde doit commencer par

pureté (D), rendement (D), intégrité (E) et consistance (E) pour évaluer les acides nucléiques dans ces quatre aspects.

Selon les habitudes expérimentales, parlons d'abord des méthodes d'évaluation de la pureté et de la concentration.

La mesure de la DO est la méthode de détection préférée et la plus simple pour les expérimentateurs.Quant au principe, je ne rentrerai pas dans les détails ici.De nombreux laboratoires utilisent désormais des spectrophotomètres ultra-micro pour analyser quantitativement directement des échantillons d'acide nucléique.Lors de l'affichage de la valeur d'absorbance, le programme donne directement la valeur de concentration (acide nucléique, protéine et colorant fluorescent) et les ratios associés.En ce qui concerne l'analyse de la valeur OD, enregistrez cette image et tout ira bien.

Liste de solutions universelles de valeur OD

image3Cependant, il y a quelques mises en garde qui doivent être apportées séparément pour vous.

(Après tout, je sais que vous devez être ceux qui économisent et attendez jusqu'à ce que vous en ayez besoin !)

Remarque 1 Équipement

La valeur OD sera affectée par différents équipements.Tant que l'OD260 se situe dans une certaine plage, les valeurs de OD230 et OD280 sont significatives.Par exemple, la plage d'absorbance de l'Eppendorf D30 commun à 260 nm est de 0 à 3 A, et celle du NanoDrop One de Thermo est à 260 nm.La plage d'absorbance de 0,5 ~ 62,5 A.

Note 2Réactif de dilution

La valeur OD peut être affectée par la dilution de différents réactifs.Par exemple, la lecture OD260/280 d'ARN purifié à pH7,5 10 mm tristampon se situe entre 1,9 et 2,1, tandis que danssolution aqueuse neutrele rapport sera inférieur, peut-être seulement 1,8-2,0, mais cela ne signifie pas que la qualité de l'ARN change Différence.

Note 3Substances résiduelles

L'existence de substances résiduelles affectera la précision de la mesure de la concentration d'acide nucléique, il est donc nécessaire d'éviter autant que possible les résidus de protéines, de phénols, de polysaccharides et de polyphénols dans les échantillons d'acides nucléiques.

Cependant, en fait, l'extraction avec des réactifs organiques est une méthode ancienne.Dans les kits commerciaux, l'effet d'extraction peut être obtenu grâce à une colonne d'adsorption à base de silice combinée à une centrifugation, en évitant les réactifs organiques toxiques et nocifs difficiles à éliminer, etc. Le problème, tel queLe kit d'extraction d'acide nucléique de Foregene, n'utilise pas de DNase/RNase et de réactifs organiques toxiques tout au long de l'opération, rapide et sûr, et lel'effet estbien(accidentellement dit qu'il était chauve, mais je sais que vous voulez savoir).

Exemple 1 : Rendement et pureté de l'extraction de l'ADN génomique

Foregene Soil DNA Isolation Kit (DE-05511) traite des échantillons de sol provenant de diverses sources, et la quantité et la pureté de l'ADN génomique obtenu sont indiquées dans le tableau suivant :
image4Exemple 2 : Rendement et pureté de l'extraction d'ARN tissulaire

Le kit d'isolement d'ARN total animal (RE-03012) a traité divers échantillons de tissus, et la quantité et la pureté de l'ARN obtenu sont indiquées dans le tableau ci-dessous (pour les tissus de souris) :
image5Cependant, ne pensez pas que vous en avez fini avec la valeur OD.Avez-vous pris soin des points clés que j'ai dessinés pour vous à l'avant ?

Avis

Les molécules d'acide nucléique fragmentées seront également calculées dans l'absorbance.En supposant que vous ayez des résidus d'ADN génomique dans l'ARN, votre valeur de DO semblera très élevée, mais la concentration réelle d'ARN ne peut pas être déterminée.Si votre ARN est Il n'est pas clair s'il y a dégradation, nous avons donc toujours besoin d'une méthode d'évaluation complète pour donner un jugement plus précis, c'est-à-dire l'évaluation de l'intégrité des acides nucléiques mentionnée dans MIQE.


Heure de publication : 13 janvier 2022