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Spécificité de détection

Dans la plupart des cas, le but de la conception des amorces est de maximiser la spécificité de la PCR.Ceci est déterminé par l'influence plus ou moins prévisible de nombreuses variables.Une variable importante est la séquence à l'extrémité 3' de l'amorce.

Il est important de noter que les tests PCR conçus pour la spécificité sont plus susceptibles de maintenir une efficacité élevée sur une large plage dynamique, car le test ne produit pas de produits d'amplification non spécifiques, ce qui concurrence les réactifs PCR ou inhibe la réaction d'amplification principale.

Bien sûr, dans certains cas, la spécificité n'est pas le plus important, par exemple, lorsque l'objectif est de quantifier des agents pathogènes étroitement liés mais différents, des normes de conception, d'optimisation et de vérification spéciales sont nécessaires.

La courbe de fusion est une méthode standard pour évaluer la spécificité des amplicons, au moins en termes d'amplification d'une seule cible.Cependant, il faut souligner que les courbes de fusion peuvent être trompeuses car, par exemple, elles peuvent être affectées par les effets combinés d'amorces sous-optimales et de faibles concentrations de matrice.

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P5 |La courbe de fusion montre les décalages de Tm obtenus à partir de deux détections de quantités différentes de deux ADN cibles.

A. À des concentrations plus élevées (ad)), il n'y a pas de dimère d'amorce évident une fois la mesure qPCR terminée.Lorsque la concentration de la matrice diminue à 50 copies (e), un produit non spécifique commence à apparaître et devient le seul produit à la concentration la plus faible (f).

B. Le test a enregistré le même Tms à toutes les concentrations cibles, et il n'y avait pas de dimère d'amorce évident même à la concentration la plus faible (5 copies).Lors de l'utilisation de ces deux méthodes de détection, aucun produit d'amplification n'a été détecté dans les NTC.

P5 montre les courbes de dissolution obtenues avec des échantillons dans lesquels la matrice est présente à différentes concentrations.P 5a montre qu'aux deux concentrations les plus faibles, les Tm des produits d'amplification non spécifiques produits sont inférieures à celle des amplicons spécifiques.

De toute évidence, cette méthode de détection ne peut pas être utilisée de manière fiable pour détecter des cibles qui existent à de faibles concentrations.

Fait intéressant, les NTC, c'est-à-dire les échantillons sans ADN du tout, n'ont pas enregistré de produits d'amplification (non spécifiques), indiquant que l'ADN génomique de fond peut participer à une amplification/polymérisation non spécifique.

Parfois, de telles amorces de fond et une amplification non spécifique ne peuvent pas être corrigées, mais il est souvent possible de concevoir une méthode de détection qui n'a pas d'amplification non spécifique dans n'importe quelle concentration de matrice et NTC (P 5b).

Ici, même l'enregistrement de l'amplification de la concentration cible avec un Cq de 35 produira une courbe de dissolution spécifique.De même, les NTC n'ont montré aucun signe d'amplification non spécifique.Parfois, le comportement de détection peut dépendre de la liqueur mère, et seule une amplification non spécifique est détectée dans certaines compositions tampons, qui peuvent être liées à différentes concentrations de Mg2+.

Stabilité de détection

L'optimisation de Ta est une étape utile dans le processus empirique de vérification et d'optimisation de la détection qPCR.Il fournit une indication directe de la robustesse de l'ensemble d'amorces en montrant la température (ou la plage de température) qui produit le Cq le plus bas sans amplifier le NTC.

La différence de sensibilité de deux à quatre fois peut ne pas être importante pour les personnes ayant une expression élevée d'ARNm, mais pour les tests de diagnostic, cela peut signifier la différence entre les résultats positifs et faux négatifs.

Les propriétés Ta des amorces qPCR peuvent varier considérablement.Certains tests ne sont pas très robustes et s'ils ne sont pas effectués sous la valeur Ta optimale des amorces, ils s'effondreront rapidement.

Ceci est important car ce type de détection est souvent problématique dans le monde réel, et la pureté de l'échantillon, la concentration d'ADN ou la présence d'autres ADN peuvent ne pas être optimales.

De plus, le nombre de copies cibles peut varier dans une large plage et les réactifs, ustensiles en plastique ou instruments peuvent être différents de ceux utilisés lors de la configuration du test.

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P6|Le gradient de température montre la robustesse différente de la détection par PCR.

A. Utilisez le mastermix Sensifast SYBR de Bioline (numéro de catalogue BIO-98050) pour effectuer une PCR sur l'ADNc préparé à partir d'ARN de cerveau humain.

B. Utilisez l'instrument CFX qPCR de Bio-Rad pour enregistrer la carte d'amplification et la courbe de dissolution de l'apalène (NM_033207, F : GCCATGGAGGAAAGTGACAAGACC, R : CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG).

C. Graphique d'amplification et courbe de fusion de ACSBG1 (NM_015162.4, F : CTACACTTCCGGCACCACTGG, R : GTCCACGTGAATTGTCTTGACTCAG).

D. Graphique d'amplification et courbe de dissolution de GFAP (NM_002055.5, F : TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R : CGAACCTCCTCCTCGTGGATCTTC).

E. Cqs enregistré à différentes températures de recuit, montrant la différence de Cq enregistrée sous un gradient de température de 7C.

P 6 montre un résultat typique d'un test indésirable, où la qPCR a été réalisée en utilisant un gradient Tas entre 59C et 67C (P 6a), en utilisant des amorces pour trois gènes spécifiques au cerveau humain.

On peut voir sur le graphique d'amplification que les amorces Opalin sont loin d'être idéales parce que leur plage Ta optimale est très étroite (Figure 6b), c'est-à-dire que les Cq sont largement dispersés, ce qui fait que les Cq sont significativement comparés à leur Cq optimal Low.

Cette méthode de détection est instable et peut conduire à une amplification sous-optimale.Par conséquent, cette paire d'amorces devrait être repensée.De plus, l'analyse de la courbe de fusion (encart) montre que la spécificité de cette méthode de détection peut également être problématique, car la courbe de fusion de chaque Ta est différente.

La méthode de détection ACSBG1 présentée en P 6c est plus robuste que la méthode de détection Opalin ci-dessus, mais elle est encore loin d'être idéale, et il est probable qu'elle puisse être améliorée.

Cependant, nous soulignons qu'il n'y a pas de lien nécessaire entre la robustesse et la spécificité, car la courbe de dissolution produite par cette méthode de détection montre la même valeur maximale dans tous les Tas (encadré).

En revanche, le test de robustesse est beaucoup plus tolérant, produisant des Cq similaires dans une large gamme de Tas, comme dans le test GFAP présenté en P 6d.

La différence de Cqs obtenue dans la même gamme de 8 degrés Celsius est inférieure à 1, et la courbe de dissolution (en médaillon) confirme les caractéristiques de détection dans cette gamme de température.Il convient de noter que la Tas calculée et la plage de Ta réelle peuvent être très différentes.

Il existe de nombreuses directives conçues pour aider les chercheurs à concevoir des amorces efficaces, dont la plupart sont basées sur des règles établies de longue date et une grande attention a été accordée à l'extrémité 3′ des amorces.Il est souvent recommandé d'inclure un G ou C à l'extrémité 3' et deux bases G ou C (pince GC), mais pas plus de deux des 5 dernières bases.

En pratique, ces règles peuvent guider les chercheurs, mais elles ne sont pas nécessairement correctes en toutes circonstances.

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P7 |L'extrémité 3' de l'amorce a peu d'effet sur la spécificité ou l'efficacité.

A. La position des amorces pour le gène humain HIF-1α (NM_181054.2).

B. Utilisez la liqueur mère Agilent Brilliant III SYBR Green (réf. 600882) pour amplifier six éléments de test.

C. Graphique d'amplification et courbe de fusion enregistrés par l'instrument CFX qPCR de Bio-Rad et les amorces 3'end.Les NTC sont indiqués en rouge.

D. Enregistrement Cqs de chaque élément de test

Par exemple, le résultat dans P 7 contredit la règle 3′end.Toutes les conceptions produisent fondamentalement les mêmes résultats, avec seulement deux combinaisons d'amorces conduisant à une amplification non spécifique dans NTC.

Cependant, nous ne pouvons pas soutenir l'effet du clip GC, car dans ce cas, utiliser A ou T comme un maximum de 30 bases ne réduit pas la spécificité.

Le test C, où l'amorce F se termine par GGCC, a enregistré Cqs dans les NTC, indiquant que l'on pourrait vouloir éviter ces séquences à l'extrémité 30.Nous soulignons que la seule façon de déterminer la meilleure séquence d'extrémité 3' d'une paire d'amorces est d'évaluer expérimentalement certaines amorces candidates.

Efficacité d'amplification

Il est important de noter que bien que la détection par PCR non spécifique ne puisse jamais devenir spécifique, l'efficacité de l'amplification peut être ajustée et maximisée de différentes manières en modifiant l'enzyme, la liqueur mère, les additifs et les conditions de cycle.

Pour évaluer l'efficacité de la détection par PCR, il est préférable d'utiliser une dilution en série de 10 ou 5 fois l'acide nucléique cible, c'est-à-dire la « méthode de la courbe standard ».

Si des amplicons PCR ou des cibles d'ADN synthétique sont utilisés pour générer une courbe standard, des dilutions en série de ces cibles doivent être mélangées avec une quantité constante d'ADN de fond (tel que l'ADN génomique).

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P8 |Courbe de dilution pour évaluer l'efficacité de la PCR.

A. Utilisez les amorces pour HIF-1 : F : AAGAACTTTTAGGCCGCTCA et R : TGTCCTGTGGTGACTTGTCC et le mastermix Brilliant III SYBR Green d'Agilent (référence 600882) pour les conditions de PCR et de courbe de fusion.

B. 100 ng d'ARN ont été soumis à une transcription inverse, dilués 2 fois, et des échantillons d'ADNc dilués en série ont été dilués 5 fois à 1 ng d'ADN génomique humain.La courbe de fusion est indiquée dans l'encart.

C. La réaction RT, la dilution et la dilution en série ont été répétées pour le deuxième échantillon d'ADNc, et les résultats étaient similaires.

P 8 montre deux courbes standard, utilisant la même méthode de détection sur deux échantillons d'ADNc différents, le résultat est la même efficacité, environ 100%, et la valeur R2 est également similaire, c'est-à-dire le degré d'ajustement entre les données expérimentales et la droite de régression ou le degré de linéarité des données.

Les deux courbes standard sont comparables, mais pas exactement identiques.Si le but est de quantifier avec précision la cible, il faut noter qu'il est inacceptable de fournir un calcul du nombre de copies sans expliquer l'incertitude

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P9 |Incertitude de mesure associée à la quantification à l'aide d'une courbe étalon.

A. Utilisez des amorces pour GAPDH (NM_002046) pour effectuer des conditions de PCR et de courbe de fusion.F : ACAGTTGCCATGTAGACC et R : TAACTGGTTGAGCCAGG et le mastermix Sensifast SYBR de Bioline (numéro de catalogue BIO-98050).

B. Graphique d'amplification, courbe de fusion et courbe standard enregistrées avec l'instrument CFX qPCR de Bio-Rad.

C. Graphique de la courbe standard et intervalle de confiance (IC) à 95 %.

D. Le nombre de copies et l'intervalle de confiance à 95 % des trois valeurs Cq dérivées de la courbe de dilution.

P 9 montre que pour un test optimisé, la variabilité inhérente d'une seule courbe standard est d'environ 2 fois (intervalle de confiance à 95 %, minimum à maximum), ce qui peut être la plus petite variabilité à laquelle on peut s'attendre.

Produit associé :

Kit de qPCR Cell Direct RT

Kit de PCR directe de queue de souris

Kit de PCR directe de tissus animaux


Heure de publication : 30 septembre 2021