Plusieurs inventions révolutionnaires dans l'histoire de la technologie de détection dans mon esprit sont la technologie d'immunomarquage basée sur le principe de la liaison spécifique antigène-anticorps, la technologie PCR et la technologie de séquençage.Aujourd'hui, nous allons parler de la technologie PCR.Selon l'évolution de la technologie PCR, les gens divisent habituellement la technologie PCR en trois générations : la technologie PCR ordinaire, la technologie PCR quantitative fluorescente en temps réel et la technologie PCR numérique.
Ctechnique PCR commune
KARY MULLIS (1944.12.28-2019.8.7)
Kary Mullis a inventé la réaction en chaîne par polymérase (réaction en chaîne par polymérase, PCR) en 1983. On raconte que lorsqu'il conduisait sa petite amie, il a soudainement eu un éclair d'inspiration et a pensé au principe de la PCR (sur les bienfaits de la conduite).Kary Mullis a reçu le prix Nobel de chimie en 1993. Le New York Times a commenté : « Très original et significatif, divisant presque la biologie en ères pré-PCR et post-PCR.
Le principe de la PCR : sous la catalyse de l'ADN polymérase, l'ADN du brin mère est utilisé comme matrice, et l'amorce spécifique est utilisée comme point de départ de l'extension, et l'ADN du brin fille complémentaire de l'ADN matrice du brin mère est copié in vitro par dénaturation, recuit, extension et autres étapes.Il s'agit d'une technologie d'amplification de synthèse d'ADN in vitro, qui peut amplifier rapidement et spécifiquement n'importe quel ADN cible in vitro.
Avantages de la PCR ordinaire
1.Méthode classique, normes internationales et nationales complètes
2.Réduction du coût des réactifs d'instrument
3.Les produits de PCR peuvent être récupérés pour d'autres expériences de biologie moléculaire
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Inconvénients de la PCR ordinaire
1.facile à polluer
2.opération lourde
3.uniquement une analyse qualitative
4.Sensibilité modérée
5.Il y a amplification non spécifique, et lorsque la bande non spécifique est de la même taille que la bande cible, elle ne peut pas être distinguée
CPCR basée sur l'électrophorèse apillaire
En réponse aux lacunes de la PCR ordinaire, certains fabricants ont introduit des instruments basés sur le principe de l'électrophorèse capillaire.L'étape d'électrophorèse après amplification par PCR est terminée dans le capillaire.La sensibilité est plus élevée, et la différence de plusieurs bases peut être distinguée et l'amplification peut être calculée par MAERKER.contenu du produit.L'inconvénient est que le produit PCR doit encore être ouvert et mis dans l'instrument, et il existe toujours un grand risque de contamination.
CapillaireEélectrophorèse
2. Technologie de PCR quantitative fluorescente en temps réel (PCR quantitative en temps réel, qPCR)La PCR quantitative fluorescente, également appelée PCR en temps réel, est une nouvelle technologie quantitative d'acide nucléique développée par PE (Perkin Elmer) en 1995. L'histoire du développement de la PCR quantitative fluorescente est une histoire de luttes émouvantes de géants tels que ABI, Roche et Bio-Rad.Si vous êtes intéressé, vous pouvez le consulter.Cette technique est actuellement la technique de PCR semi-quantitative la plus mature et la plus largement utilisée.
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Méthode de teinture fluorescente (SYBR Green I) :SYBR Green I est le colorant de liaison à l'ADN le plus couramment utilisé pour la PCR quantitative, qui se lie de manière non spécifique à l'ADN double brin.A l'état libre, le SYBR Green émet une faible fluorescence, mais une fois lié à l'ADN double brin, sa fluorescence est multipliée par 1000.Par conséquent, le signal fluorescent total émis par une réaction est proportionnel à la quantité d'ADN double brin présent et augmentera avec l'augmentation du produit amplifié.Étant donné que le colorant se lie de manière non spécifique à l'ADN double brin, des résultats faussement positifs peuvent être générés.
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Méthode de la sonde fluorescente (technologie Taqman) : PendantEn amplification PCR, une sonde fluorescente spécifique est ajoutée en même temps qu'un couple d'amorces.La sonde est un oligonucléotide linéaire, avec un groupe rapporteur fluorescent et un groupe extincteur fluorescent respectivement marqués aux deux extrémités.Lorsque la sonde est intacte, le signal fluorescent émis par le groupe rapporteur est absorbé par le groupe extincteur, et la détection Il n'y a pas de signal fluorescent ;pendant l'amplification PCR (au stade de l'extension), l'activité Dicer 5'-3' de l'enzyme Taq va digérer et dégrader la sonde, de sorte que le groupe fluorescent rapporteur et le groupe fluorescent extincteur soient séparés, de sorte que le système de surveillance de la fluorescence Le signal fluorescent peut être reçu, c'est-à-dire qu'à chaque fois qu'une chaîne d'ADN est amplifiée, une molécule fluorescente se forme, ce qui réalise la synchronisation complète de l'accumulation de signaux fluorescents et la formation de produits PCR.La méthode de la sonde Taqman est la méthode de détection la plus couramment utilisée en détection clinique.
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Avantages de la qPCR
1.La méthode est mature et l'équipement de support et les réactifs sont complets
2.Coût moyen des réactifs
3.facile à utiliser
4.Haute sensibilité et spécificité de détection
Inconvénients de la qPCR
La mutation du gène cible conduit à une détection manquée.
Le résultat de la détection du modèle à faible concentration ne peut pas être déterminé.
Il y a une grande erreur lors de l'utilisation de la courbe standard pour la détection quantitative.
3. Technologie PCR numérique (PCR numérique, dPCR)
La PCR numérique est une technique de quantification absolue des molécules d'acide nucléique.Par rapport à la qPCR, la PCR numérique peut lire directement le nombre de molécules d'ADN/ARN, qui est la quantification absolue des molécules d'acide nucléique dans l'échantillon de départ.En 1999, Bert Vogelstein et Kenneth W. Kin-zler ont formellement proposé le concept de dPCR.
En 2006, Fluidigm a été le premier à produire un instrument commercial de dPCR sur puce.En 2009, Life Technologies a lancé les systèmes OpenArray et QuantStudio 12K Flex dPCR.En 2013, Life Technologies a lancé le système QuantStudio 3DdPCR, qui utilise la technologie des puces microfluidiques nanométriques à haute densité pour répartir uniformément les échantillons dans 20 000 cellules individuelles.dans le puits de réaction.
En 2011, Bio-Rad a lancé l'instrument QX100 dPCR à base de gouttelettes, qui utilise la technologie eau dans l'huile pour répartir uniformément l'échantillon sur 20 000 gouttelettes d'eau dans l'huile, et utilise un analyseur de gouttelettes pour analyser les gouttelettes.En 2012, RainDance a lancé l'instrument RainDrop dPCR, piloté par un gaz à haute pression, pour diviser chaque système de réaction standard en une émulsion de réaction contenant 1 million à 10 millions de micro-gouttelettes de niveau picolitre.
Jusqu'à présent, la PCR numérique a formé deux factions principales, le type de puce et le type de gouttelette.Quel que soit le type de PCR numérique, ses principes fondamentaux sont la dilution limite, la PCR au point final et la distribution de Poisson.Le système de réaction PCR standard contenant des matrices d'acide nucléique est divisé de manière égale en dizaines de milliers de réactions PCR, qui sont réparties sur des puces ou des microgouttelettes, de sorte que chaque réaction contienne autant que possible une molécule matrice et qu'une réaction PCR à une seule molécule est effectuée.Par lecture de la fluorescence La présence ou l'absence du signal est comptée, et la quantification absolue est effectuée après étalonnage de la distribution statistique de Poisson.
Voici les caractéristiques de plusieurs plateformes PCR numériques que j'ai utilisées :
1. PCR numérique de gouttelettes Bio-Rad QX200 Bio-RadQX200 est une plateforme de PCR numérique très classique, le processus de détection de base : 20 000 échantillons sont générés par le générateur de gouttelettes Les micro-gouttelettes d'eau dans l'huile sont amplifiées sur une machine de PCR ordinaire, et enfin le signal de fluorescence de chaque micro-gouttelette est lu par un lecteur de micro-gouttelettes.L'opération est plus compliquée, et le risque de pollution est moyen.
PCR numérique micro-gouttelettes Xinyi TD1Xinyi TD1 est une plate-forme PCR numérique domestique, le processus de détection de base : générer 30 000 à 50 000 gouttelettes d'eau dans l'huile via un générateur de gouttelettes, amplifier sur un instrument PCR commun et enfin passer Le lecteur de gouttelettes lit le signal fluorescent de chaque gouttelette.La génération et la lecture des gouttelettes dans cette plate-forme sont effectuées dans une puce dédiée avec un faible risque de contamination.
PCR numérique sur puce micro-gouttelettes STILLA NaicaSTILLA Naica est une plateforme PCR numérique relativement nouvelle.Le processus de détection de base est : ajoutez la solution de réaction à la puce, placez la puce dans le système de génération et d'amplification de micro-gouttelettes et générez 30 000 micro-gouttelettes.Étalez sur la puce et l'amplification PCR est terminée sur la puce.Ensuite, la puce amplifiée est transférée au système d'analyse de lecture de micro-gouttelettes, et le signal fluorescent est lu en prenant des photos.Étant donné que l'ensemble du processus se déroule dans une puce fermée, le risque de contamination est faible.
4. PCR numérique à puce 3D ThermoFisher QuantStudio
ThermoFisher QuantStudio 3D est une autre plate-forme PCR numérique classique basée sur une puce.Son processus de détection de base est : ajouter la solution de réaction dans l'épandeur et étaler la solution de réaction uniformément sur la puce avec 20 000 micropuits à travers l'épandeur., placez la puce sur la machine PCR pour amplifier, et enfin mettez la puce dans le lecteur et prenez une photo pour lire le signal fluorescent.L'opération est relativement compliquée, et l'ensemble du processus est réalisé dans une puce fermée, et le risque de contamination est faible.
5. PCR numérique à puce JN MEDSYS Clarity
JN MEDSYS Clarity est une plate-forme PCR numérique de type puce relativement nouvelle.Son processus de détection de base consiste à ajouter la solution de réaction dans l'applicateur et à répartir uniformément la solution de réaction sur 10 000 tubes PCR fixés dans le tube PCR à travers l'applicateur.Sur la puce microporeuse, la solution de réaction pénètre dans la puce par capillarité, et le tube PCR avec la puce est placé sur la machine PCR pour amplification, et enfin la puce est placée dans le lecteur pour lire le signal fluorescent en prenant une photo.L'opération est plus compliquée.Le risque de contamination est faible.
Les paramètres de chaque plateforme de PCR numérique sont résumés comme suit :
Les indicateurs d'évaluation de la plateforme PCR numérique sont : le nombre d'unités fractionnées, le nombre de canaux fluorescents, la complexité de fonctionnement et le risque de contamination.Mais le plus important est la précision de détection.Une façon d'évaluer les plates-formes PCR numériques consiste à utiliser plusieurs plates-formes PCR numériques pour se vérifier mutuellement, et une autre consiste à utiliser des substances standard avec des valeurs précises.
Avantages de la dPCR
1.Atteindre une quantification absolue
2.Sensibilité et spécificité plus élevées
3.Peut détecter des échantillons à faible copie
Inconvénients de la dPCR1. Équipement et réactifs coûteux 2. Opération compliquée et temps de détection long 3. Plage de détection étroite
À l'heure actuelle, les trois générations de technologie PCR ont leurs propres avantages et inconvénients, et chacune a ses propres domaines d'application, et ce n'est pas une relation qu'une génération remplace l'autre.Les progrès continus de la technologie ont insufflé une nouvelle vitalité à la technologie PCR, lui permettant de déverrouiller une direction d'application après l'autre, rendant la détection des acides nucléiques plus pratique et plus précise.
Source : Le Dr Yuan vous emmène faire des tests
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Heure de publication : 18 novembre 2022
