La PCR est la technologie d'amplification d'acide nucléique la plus largement utilisée et est largement utilisée en raison de sa sensibilité et de sa spécificité.Cependant, la PCR nécessite une dénaturation thermique répétée et ne peut pas se débarrasser des limitations liées à l'utilisation d'instruments et d'équipements, ce qui limite son application dans les tests cliniques sur le terrain.

Depuis le début des années 1990, de nombreux laboratoires ont commencé à développer une technologie d'amplification à température constante qui ne nécessite pas de dénaturation thermique.Maintenant, ils ont développé une technologie d'amplification isotherme à médiation par boucle, une technologie d'amplification isotherme de remplacement de brin, une technologie d'amplification isotherme en cercle roulant et une dépendance à la séquence d'acide nucléique.Technologie d'amplification isotherme et autres technologies. 

Lamplification isotherme médiée par oop

Le principe d'amplification est basé sur le fait que l'ADN est dans un état d'équilibre dynamique à environ 65°C.Lorsqu'une amorce est appariée en bases et étendue à la partie complémentaire de l'ADN double brin, l'autre brin se dissocie et devient simple brin.

À cette température, l'ADN utilise 4 amorces spécifiques pour s'appuyer sur une ADN polymérase à déplacement de brin pour faire circuler la synthèse d'ADN à déplacement de brin en continu.

Déterminez d'abord les 6 régions spécifiques F3, F2, F1, B1, B2, B3 sur le gène cible, puis concevez 4 amorces basées sur ces 6 régions spécifiques (comme indiqué dans la figure ci-dessous) :

L'amorce interne avant (FIP) est composée de F1c et F2.

L'amorce interne arrière (BIP) est composée de B1c et B2, et TTTT est utilisé comme espaceur au milieu.

Les amorces externes F3 et B3 sont respectivement composées des régions F3 et B3 sur le gène cible.

Dans le système de réaction LAMP, la concentration de l'amorce interne est plusieurs fois celle de l'amorce externe.L'amorce interne est d'abord combinée avec le brin matrice pour synthétiser un brin complémentaire pour former un double brin d'ADN.Ensuite, l'amorce externe est combinée avec le brin matrice pour former un double brin d'ADN.Sous l'action de la BstDNA polymérase, le brin complémentaire synthétisé par l'amorce interne est libéré.Après une série de réactions, le brin complémentaire forme finalement un seul brin d'ADN avec une structure en haltère.

Le simple brin d'ADN à structure haltère lui-même est utilisé comme matrice pour former en continu un ADN à structure tige-boucle de transition avec une extrémité ouverte.Les amorces internes et externes guident l'ADN de la structure tige-boucle transitionnelle pour subir en continu des réactions de déplacement et d'extension de brin, et forment finalement plusieurs structures tige-boucle de différentes longueurs.Mélange d'ADN.

Avantages et inconvénients de l'amplification isotherme en boucle

Avantages de la LAMPE :

(1) Efficacité d'amplification élevée, qui peut amplifier efficacement 1 à 10 copies du gène cible en 1 h, et l'efficacité d'amplification est 10 à 100 fois supérieure à celle de la PCR ordinaire.

(2) Le temps de réaction est court, la spécificité est forte et aucun équipement spécial n'est requis.

Les défauts de LAMP :

(1) Les exigences pour les amorces sont particulièrement élevées.

(2) Le produit amplifié ne peut pas être utilisé pour le clonage et le séquençage, mais uniquement pour le jugement.

(3) En raison de sa forte sensibilité, il est facile de former des aérosols, provoquant des faux positifs et affectant les résultats du test.

Samplification de déplacement de bande

L'amplification par déplacement de brin (SDA) est une technique d'amplification d'ADN isotherme in vitro basée sur une réaction enzymatique proposée pour la première fois par le chercheur américain Walker en 1992.

Le système de base de la SDA comprend une endonucléase de restriction, une ADN polymérase avec une activité de déplacement de brin, deux paires d'amorces, des dNTP et des ions calcium et magnésium et des systèmes tampons.

Le principe de l'amplification par déplacement de brin est basé sur la séquence de reconnaissance de l'endonucléase de restriction modifiée chimiquement aux deux extrémités de l'ADN cible.L'endonucléase ouvre l'espace dans le brin d'ADN au niveau de son site de reconnaissance, et l'ADN polymérase étend l'extrémité 3 'de l'espace et remplace le brin d'ADN suivant.

Les simples brins d'ADN remplacés peuvent être combinés avec des amorces et étendus en doubles brins par l'ADN polymérase.Ce processus est répété en continu, de sorte que la séquence cible est efficacement amplifiée.

Avantages et inconvénients de la technologie d'amplification par déplacement de brin

Avantages du SDA :

L'efficacité d'amplification est élevée, le temps de réaction est court, la spécificité est forte et aucun équipement spécial n'est requis.

Lacunes de SDA:

Les produits ne sont pas uniformes et certains produits simple brin et double brin sont toujours produits dans le cycle SDA, et des résidus se produiront inévitablement lorsqu'ils seront détectés par électrophorèse.

Ramplification du cercle roulant

L'amplification en cercle roulant (RCA) est proposée en s'appuyant sur la méthode de copie de l'ADN d'organismes pathogènes par cercle roulant.Il fait référence à l'utilisation d'ADN circulaire simple brin comme matrice à une température constante, et d'une ADN polymérase spéciale (telle que Phi29) ) Sous l'action de la synthèse d'ADN en cercle roulant pour réaliser l'amplification du gène cible.

RCA peut être divisé en amplification linéaire et amplification exponentielle.L'efficacité du RCA linéaire peut atteindre 10⁵fois, et l'efficacité du RCA exponentiel peut atteindre 10⁹fois.

Distinction simple, comme le montre la figure ci-dessous, l'amplification linéaire a n'utilise qu'une seule amorce, l'amplification exponentielle b a 2 amorces.

Le RCA linéaire est également appelé RCA à amorce unique.Une amorce se lie à l'ADN circulaire et est allongée par l'action de l'ADN polymérase.Le produit est un simple brin linéaire avec un grand nombre de séquences répétitives des milliers de fois la longueur d'une seule boucle.

Étant donné que le produit de RCA linéaire est toujours connecté à l'amorce de départ, la fixation facile du signal est un avantage majeur.

RCA exponentiel, également connu sous le nom d'amplification hyper ramifiée HRCA (RCA hyper ramifié), dans le RCA exponentiel, une amorce amplifie le produit RCA, la deuxième amorce s'hybride avec le produit RCA et s'étend, et le remplacement est déjà lié au produit RCA Les amorces en aval étendent le brin, et répètent l'extension et le remplacement pour produire un produit d'amplification RCA dendritique.

Les avantages et les inconvénients de l'amplification des acides nucléiques en cercle roulant

Avantages de RCA :

Haute sensibilité, bonne spécificité et opération facile.

Les défauts de RCA :

Problèmes de fond lors de la détection du signal.Au cours de la réaction RCA, la sonde de cadenas non circulée et l'ADN ou l'ARN matrice de la sonde non liée peuvent générer des signaux de fond. 

Namplification basée sur la séquence d'acide nucléique

L'amplification basée sur la séquence d'acide nucléique (NASBA) est une nouvelle technologie développée sur la base de la PCR.Il s'agit d'une amplification d'acide nucléique continue et isotherme guidée par un couple d'amorces avec une séquence promotrice T7.La technologie peut amplifier l'ARN matrice d'environ 109 fois en environ 2 heures, ce qui est 1000 fois plus élevé que la méthode PCR conventionnelle et ne nécessite pas d'équipement spécial.

Cette technologie a été utilisée pour le diagnostic rapide des maladies dès son apparition, et de nombreuses entreprises utilisent actuellement cette méthode dans des kits de détection d'ARN.

Bien que l'amplification d'ARN puisse également utiliser la technologie PCR de transcription inverse, NASBA a ses propres avantages : elle peut être réalisée dans des conditions de température relativement constantes, et elle est plus stable et précise que la technologie PCR traditionnelle.

La réaction est à 41 degrés Celsius et nécessite une transcriptase inverse AMV (virus de la myéloblastose aviaire), une RNase H, une ARN polymérase T7 et une paire d'amorces pour se terminer.

Le processus comprend principalement :

L'amorce sens contient la séquence complémentaire du promoteur T7.Au cours de la réaction, l'amorce sens se lie au brin d'ARN et est catalysée par l'enzyme AMV pour former un double brin ADN-ARN.

La RNase H digère l'ARN dans l'hybride double brin et retient l'ADN simple brin.

Sous l'action de l'amorce inverse et de l'enzyme AMV, un double brin d'ADN contenant la séquence promotrice T7 se forme.

Sous l'action de l'ARN polymérase T7, le processus de transcription est achevé et une grande quantité d'ARN cible est produite.

Avantages de NASBA :

(1) Son amorce a une séquence promotrice T7, mais l'ADN double brin étranger n'a pas de séquence promotrice T7 et ne peut pas être amplifié, donc cette technologie a une spécificité et une sensibilité élevées.

(2) NASBA incorpore directement le processus de transcription inverse dans la réaction d'amplification, raccourcissant le temps de réaction.

Inconvénients de la NASBA :

(1) Les composants de la réaction sont plus compliqués.

(2) Trois types d'enzymes sont nécessaires pour augmenter le coût de la réaction.