La PCR en temps réel, également connue sous le nom de PCR quantitative ou qPCR, est une méthode de surveillance et d'analyse en temps réel des produits d'amplification PCR.
Parce que la PCR quantitative présente les avantages d'une opération simple, rapide et pratique, d'une sensibilité élevée, d'une bonne répétabilité et d'un faible taux de contamination, elle est largement utilisée dans les tests médicaux, l'évaluation de l'efficacité des médicaments, la recherche sur l'expression génique, la recherche transgénique, la détection des gènes, la détection des agents pathogènes, la détection des animaux et des plantes., tests alimentaires et autres domaines.
Ainsi, que vous soyez engagé dans la recherche fondamentale en sciences de la vie, ou salarié de sociétés pharmaceutiques, de sociétés d'élevage, de sociétés agro-alimentaires, ou encore de bureaux d'inspection entrée-sortie et de quarantaine, de services de surveillance environnementale, d'hôpitaux et autres unités, vous serez plus ou moins exposé à Ou vous avez besoin de connaître les connaissances pour maîtriser la PCR quantitative.

Principe de la PCR en temps réel

La PCR en temps réel est une méthode dans laquelle des substances fluorescentes sont ajoutées au système de réaction PCR, et l'intensité du signal de fluorescence dans le processus de réaction PCR est surveillée en temps réel par un instrument PCR quantitatif, et enfin les données expérimentales sont analysées et traitées.

【Courbe d'amplification】est la courbe décrivant le processus dynamique de la PCR.La courbe d'amplification de la PCR n'est pas réellement une courbe exponentielle standard, mais une courbe sigmoïde.

[Phase plate-forme de la courbe d'amplification]Avec l'augmentation du nombre de cycles de PCR, l'inactivation de l'ADN polymérase, l'épuisement des dNTP et des amorces, et l'inhibition de la réaction de synthèse par le sous-produit de réaction pyrophosphate, etc., la PCR ne se développe pas toujours de manière exponentielle., et finira par atteindre un plateau.

[Région de croissance exponentielle de la courbe d'amplification]Bien que la phase de plateau varie considérablement, dans une certaine région de la région de croissance exponentielle de la courbe d'amplification, la répétabilité est très bonne, ce qui est très important pour l'analyse quantitative de la PCR.

[Valeur seuil et valeur Ct]Nous fixons la valeur limite de détection de fluorescence à la position appropriée dans la zone de croissance exponentielle de la courbe d'amplification, à savoir la valeur seuil (Threshold).L'intersection de la valeur seuil et de la courbe d'amplification est la valeur Ct, c'est-à-dire que la valeur Ct fait référence au nombre de cycles (Threshold Cycle) lorsque la valeur seuil est atteinte.

Le graphique ci-dessous montre clairement la relation entre la ligne de seuil et la courbe d'amplification, le seuil et la valeur Ct.

【Comment quantifier ?】

Il a été prouvé par la théorie mathématique que la valeur Ct a une relation linéaire inverse avec le logarithme du nombre de modèles initiaux.La PCR en temps réel surveille les produits d'amplification PCR en temps réel et les quantifie pendant la phase d'amplification exponentielle.

Pour chaque cycle de PCR, l'ADN a augmenté de façon exponentielle de 2 fois et a rapidement atteint un plateau.

En supposant que la quantité d'ADN de départ est A₀ , après n cycles, la quantité théorique de produit ADN peut être exprimée comme suit :

A _n =A ₀ ×2ⁿ

Ensuite, plus la quantité initiale d'ADN A 0 est élevée, plus tôt la quantité du produit amplifié atteint la valeur de détection An, et le nombre de cycles lorsqu'il atteint An est la valeur Ct.C'est-à-dire que plus la quantité initiale d'ADN A0 est élevée, plus la courbe d'amplification culmine tôt et, de manière correspondante, le nombre requis de cycles n est plus petit.

Nous effectuons une dilution en gradient de l'étalon de concentration connue et l'utilisons comme modèle pour la PCR en temps réel, et une série de courbes d'amplification sera obtenue à intervalles égaux dans l'ordre de la quantité d'ADN de départ de plus à moins.Selon la relation linéaire entre la valeur Ct et le logarithme du nombre de modèles de départ, un[courbe standard] peut être créée .

En remplaçant la valeur Ct de l'échantillon avec une concentration inconnue dans la courbe standard, la quantité de matrice initiale de l'échantillon avec une concentration inconnue peut être obtenue, ce qui est le principe quantitatif de la PCR en temps réel.

Méthode de détection de la PCR en temps réel

La PCR en temps réel détecte les produits d'amplification PCR en détectant l'intensité de fluorescence dans le système de réaction.

Principe de la méthode d'incorporation de colorant fluorescent】

Colorants fluorescents, tels que TB Green ® , peuvent se lier de manière non spécifique à l'ADN double brin dans les systèmes de PCR et devenir fluorescents lors de la liaison.

L'intensité de fluorescence dans le système de réaction a augmenté de façon exponentielle avec l'augmentation des cycles de PCR.En détectant l'intensité de fluorescence, la quantité d'amplification d'ADN dans le système de réaction peut être surveillée en temps réel, puis la quantité de matrice de départ dans l'échantillon peut être estimée de manière inverse.

【Principe de la méthode des sondes fluorescentes】

sonde fluorescenteest une séquence d'acide nucléique avec un groupe fluorescent à l'extrémité 5' et un groupe d'extinction à l'extrémité 3', qui peut se lier spécifiquement à la matrice.Lorsque la sonde est intacte, la fluorescence émise par le fluorophore est éteinte par le groupe d'extinction et ne peut pas devenir fluorescente.Lorsque la sonde est décomposée, la substance fluorescente se dissocie et émet de la fluorescence.

Une sonde fluorescente est ajoutée à la solution de réaction PCR.Au cours du processus de recuit, la sonde fluorescente se liera à la position spécifique de la matrice.Au cours du processus d'extension, l'activité exonucléase 5 '→ 3' de l'enzyme PCR peut décomposer la sonde fluorescente hybridée avec la matrice, et la substance fluorescente est dissociée pour émettre de la fluorescence.En détectant l'intensité de fluorescence de la sonde dans le système de réaction, l'objectif de contrôle de la quantité d'amplification du produit de PCR peut être atteint.

【Sélection de la méthode de détection de fluorescence】

Si elle est utilisée pour distinguer des séquences à forte homologie et effectuer une détection par PCR multiplex telle qu'une analyse de typage SNP, la méthode de la sonde fluorescente est irremplaçable.
Pour d'autres expériences de PCR en temps réel, une méthode de chimère fluorescente simple, facile et peu coûteuse peut être utilisée.

sondesForte spécificité, capable de PCR multiplex

Défaut

Exigences de haute spécificité pour l'amplification ;

la PCR multiplex ne peut pas être réaliséeNécessité de concevoir des sondes spécifiques, coût élevé ;

la conception de la sonde est parfois difficile

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