1. Détecter l'absorbance de la solution d'ARN
L'absorbance à 280, 320, 230 et 260 nm représente les valeurs de l'acide nucléique, du bruit de fond (turbidité de la solution), de la concentration en sel et de la matière organique telle que la protéine, respectivement.En règle générale, ne regardez que OD260/OD280 (Ratio, R).Lorsque 1,8 ~ 2,0, nous pensons que la contamination des protéines ou d'autres matières organiques dans l'ARN peut être tolérée, mais il convient de noter que lorsque le Tris est utilisé comme tampon pour détecter l'absorbance, la valeur R peut être supérieure à 2 (généralement elle devrait être <2,2).Lorsque R<1,8, la pollution des protéines ou d'autres matières organiques dans la solution est plus évidente, et le sort de l'ARN peut être déterminé en fonction des besoins.Lorsque R> 2,2, cela signifie que l'ARN a été hydrolysé en un seul acide nucléique.
2. Modèle électrophorétique de l'ARN
Généralement, le gel dénaturant est utilisé pour l'électrophorèse de l'ARN, mais si c'est uniquement pour détecter la qualité de l'ARN, le gel dénaturant n'est pas nécessaire et un gel d'agarose ordinaire peut être utilisé.Le but de l'électrophorèse est de détecter l'intégrité des bandes 28S et 18S et leur rapport, ou l'intégrité du frottis d'ARNm.Généralement, si les bandes 28S et 18S sont lumineuses, claires et nettes (en se référant aux bords des bandes sont claires), et que la luminosité de 28S est plus du double de celle de la bande 18S, nous considérons que la qualité de l'ARN est bonne.
Ce qui précède sont les deux méthodes que nous utilisons couramment, mais aucune de ces deux méthodes ne peut nous dire clairement s'il y a de la RNase résiduelle dans la solution d'ARN.S'il y a une très petite quantité de RNase dans la solution, il nous est difficile de la détecter avec la méthode ci-dessus, mais la plupart des réactions enzymatiques ultérieures sont effectuées à plus de 37 degrés et pendant une longue période.De cette façon, s'il y a une très petite quantité de RNase dans la solution d'ARN, alors il y aura un environnement et un temps très appropriés pour jouer leur rôle dans les expériences ultérieures, et bien sûr l'expérience sera froide à ce moment.Ci-dessous, nous introduisons une méthode qui peut confirmer s'il y a de la RNase résiduelle dans la solution d'ARN.
3. Test de conservation de la chaleur
Selon la concentration de l'échantillon, prélever deux 1000 ng d'ARN de la solution d'ARN et l'ajouter à un tube à centrifuger de 0,5 ml, et le compléter avec un tampon Tris pH 7,0 jusqu'à un volume total de 10 ul, puis sceller le bouchon du tube.Mettez l'un d'eux dans un bain-marie à température constante à 70°C et maintenez-le au chaud pendant 1 h.L'autre partie a été conservée dans un réfrigérateur à -20°C pendant 1 h.Lorsque le temps est écoulé, retirez les deux échantillons pour l'électrophorèse.Une fois l'électrophorèse terminée, comparez les bandes électrophorétiques des deux.Si les bandes des deux sont cohérentes ou n'ont pas de différence significative (bien sûr, leurs bandes remplissent également les conditions de la méthode 2), cela signifie qu'il n'y a pas de contamination résiduelle par la RNase dans la solution d'ARN et que la qualité de l'ARN est très bonne.Au contraire, si l'échantillon incubé à 70°C montre une dégradation évidente, cela indique qu'il y a une contamination par la RNase dans la solution d'ARN.
2 Méthodes et techniques expérimentales d'extraction d'ARN
Les problèmes que nous rencontrons souvent lors de l'extraction d'ARN sont les suivants : (1) le rendement en ARN est faible ;(2) l'ARN a une grave pollution saline;(3) l'ARN présente une grave pollution par les solvants organiques;(4) dégradation de l'échantillon et autres problèmes
1. Réactifs d'extraction d'ARN total couramment utilisés
La méthode à l'isothiocyanate de guanidine et la méthode au Trizol sont les méthodes les plus couramment utilisées pour l'extraction de l'ARN total à partir de tissus animaux et de cellules animales.Il est particulièrement adapté aux petits échantillons et aux tissus particulièrement difficiles à extraire, comme l'extraction de l'ARN total de la peau de lapin et du tissu conjonctif animal ;en outre, Trizol, en tant que réactif de lyse à usage général, peut également être utilisé pour l'extraction de tissus végétaux, de bactéries, de champignons et d'autres tissus.Pour les tissus végétaux contenant des polysaccharides et des polyphénols, comme le camellia oleifera, les feuilles de thé, le colza, etc., la méthode CTAB peut également être utilisée pour extraire l'ARN total.
En tant que méthode conventionnelle, la méthode à double colonne est également très populaire en raison de son fonctionnement à température normale, de l'absence d'ajout de RNase et de la sécurité - pas de chloroforme, de phénols et d'autres réactifs organiques pour l'extraction.(produits recommandés )
2. Extraction de l'ARN total des tissus animaux
(1) Essayez de choisir des tissus frais, s'ils ne sont pas frais (de préférence dans les trois mois - réfrigérateur à 80 ℃ ou congelés dans de l'azote liquide. Lorsque vous coupez des tissus, ne coupez pas directement à température ambiante, assurez-vous de le mettre sur la glacière, essayez d'éviter la congélation et la décongélation répétées.
(2) Utilisez des ciseaux et des pincettes propres pour couper un petit morceau de tissu, essayez de couper la partie centrale du tissu lors de la coupe de l'échantillon, ou coupez d'abord le grand morceau de tissu à partir du milieu, puis coupez l'échantillon à la position d'incision fraîche.Le tissu retiré doit être entièrement déchiqueté, mettre le tissu déchiqueté dans un tube EP sans RNase, ajouter le lysat, le tissu déchiqueté doit être entièrement exposé au lysat et se préparer à l'homogénéisation.
(3) Pour les tissus normaux, sélectionnez des tissus de la taille d'un haricot mungo (30 à 60 mg) pour l'homogénéisation.Si les tissus contiennent une grande quantité de protéines, de graisses ou de tissus fibreux denses tels que le foie, augmentez ou diminuez de manière appropriée la quantité de tissus coupés (facultatif) Choisissez 10 ~ 20 mg).
(4) Si du muscle de poisson, de la chair de crevettes, des méduses et d'autres tissus à forte teneur en eau sont extraits, le volume de l'échantillon doit être augmenté de manière appropriée (recommandé 100-200 mg).
(5) Si les conditions le permettent, le tissu animal peut être directement extrait après avoir été homogénéisé avec un homogénéisateur de tissu à passage élevé, s'il n'existe pas un tel équipement.
(6) L'ARN obtenu après l'extraction finale doit être placé immédiatement sur la glacière pour réduire la dégradation de l'ARN.
3. Extraction d'ARN de cellules animales
(1) Cellules en suspension : centrifuger directement et jeter le milieu, laver avec du PBS stérile 1 à 2 fois, puis suspendre avec une quantité appropriée de PBS, puis ajouter le lysat pour la lyse.Ne pas ajouter le lysat directement aux cellules précipitées après avoir complètement jeté le liquide.Cela entraînera l'adhésion du paquet d'histones libéré après les cellules lysées sur la couche externe à l'extérieur des cellules précipitées, limitant ainsi le contact des cellules à l'intérieur du culot avec le lysat., entraînant une lyse cellulaire incomplète et un rendement réduit en ARN.
(2) Cellules semi-adhérentes ou non étroitement adhérentes : après avoir jeté le milieu, laver avec du PBS 1 à 2 fois, puis absorber directement une quantité appropriée de PBS et souffler la boîte de culture avec une pipette ou un pistolet pour souffler les cellules et les transférer dans des cellules sans ARN.Ajouter le lysat au tube EP de l'enzyme pour l'extraction.
(3) Cellules adhérentes : doivent d'abord être digérées avec de la trypsine, puis collectées dans des tubes EP sans RNase, centrifugées pour éliminer le surnageant, lavées 1 à 2 fois avec du PBS pour éliminer l'excès de trypsine et remises en suspension avec une quantité appropriée de PBS. Ensuite, passez à l'étape d'extraction.
4. Extraction d'ARN végétal
Les tissus végétaux sont riches en composés phénoliques, ou riches en polysaccharides, ou contiennent certains métabolites secondaires non identifiés, ou ont une activité élevée de RNase.Ces substances sont étroitement combinées avec l'ARN après la lyse cellulaire pour former des complexes insolubles ou des précipités colloïdaux, difficiles à éliminer.Par conséquent, lorsque nous extrayons des tissus végétaux, nous devons choisir un kit pour plantes.Le lysat du kit peut résoudre efficacement les problèmes d'oxydation facile des polyphénols et de séparation des composés polysaccharidiques et des acides nucléiques.
(Pour l'extraction d'ARN végétaux polysaccharidiques polyphénols, produits recommandés :
(1) La peau, la pulpe, les graines, les feuilles, etc. de la plante doivent être entièrement broyées dans un mortier.Pendant le processus de broyage, l'azote liquide doit être réapprovisionné à temps pour éviter de faire fondre l'échantillon.L'échantillon de sol doit être rapidement ajouté au lysat et secoué pour éviter la dégradation de l'ARN.
(2) Pour les échantillons riches en fibres tels que les feuilles de riz et de blé, la quantité d'extraction doit être réduite de manière appropriée, sinon le broyage et la lyse des tissus ne seront pas complets, ce qui entraînera un faible rendement d'ARN extrait.
(3) Pour les tissus végétaux à forte teneur en eau, tels que les grenades, les pastèques, les pêches, etc., la taille de l'échantillon doit être augmentée de manière appropriée (100-200 mg est facultatif).
(4) Il est généralement recommandé d'utiliser de l'azote liquide pour les tissus végétaux, tels que les feuilles de plantes, les rhizomes, les fruits durs et d'autres matériaux, afin de bien mortariser les ingrédients dans un mortier, puis de procéder à l'étape d'extraction.Les homogénéisateurs de tissus conventionnels peuvent ne pas être efficaces pour homogénéiser les tissus végétaux et ne sont généralement pas recommandés.
5. Précautions pour l'extraction d'ARN
(1) Les échantillons de tissus doivent être aussi frais que possible pour éviter les congélations et décongélations répétées.
(2) Le tissu doit être entièrement broyé lors de l'extraction, et la quantité de tissu ne doit pas être trop petite, encore moins trop.
(3) Un temps d'incubation suffisant doit être accordé après l'ajout du lysat pour lyser complètement l'échantillon.
(4) Lors de l'utilisation de la méthode Trizol pour l'extraction, le principe d'absorption du surnageant après stratification est "préfère inhaler moins qu'inhaler plus", et ne doit pas extraire vers la couche intermédiaire, sinon cela entraînera une grave contamination de l'ADN génomique.
(5) Lors du lavage, le liquide de lavage doit s'infiltrer complètement autour de la paroi du tube pour assurer un lavage en profondeur.
(6) Pour la méthode d'extraction sur colonne, en plus de détacher la colonne après le lavage, la colonne d'adsorption doit également être placée dans un banc ultra-propre et soufflée pendant 5 à 10 minutes pour évaporer complètement le solvant organique à sec.
(7) Lors de la dernière élution de la méthode de la colonne, après avoir ajouté de l'eau DEPC, elle doit être incubée pendant 3 à 5 minutes, ou l'eau DEPC doit être chauffée à 60°C à l'avance pour augmenter le rendement d'élution.Dans la méthode traditionnelle de clivage Trizol et de précipitation à l'isopropanol, l'ARN final est dissous dans de l'eau DEPC, donc un temps approprié doit être donné pour la dissolution, et le fond du tube à centrifuger doit être soufflé en continu avec une pointe de pipette.
3Ttrois causes et solutions pour une faible concentration d'ARN/mauvaise qualité
1. Le rendement est trop faible
L'échantillon extrait est trop faible, la quantité totale est insuffisante ou l'échantillon extrait est trop important et la lyse n'est pas complète ;le tissu ou les cellules de qualité appropriée doivent être utilisés pour l'extraction, le prétraitement de l'échantillon doit être bien fait et la lyse doit être suffisante.
2. Résidus du génome
Lors de l'extraction par la méthode Trizol, lorsque le surnageant est aspiré dans la couche intermédiaire après la stratification, une grave contamination du génome sera causée ;des précautions supplémentaires doivent être prises lors de la superposition pour éviter d'aspirer dans la couche intermédiaire.Si la méthode de la colonne est utilisée pour l'extraction, un kit contenant de la DNase I peut être sélectionné pour l'extraction.L'acide nucléique adsorbé sur la membrane est directement digéré par la DNase I, ce qui peut réduire considérablement les résidus d'ADN.
3. Dégradation de l'ARN
Il peut s'agir de la dégradation de l'échantillon extrait lui-même ou de la dégradation causée lors du processus d'extraction ;dans la mesure du possible, des échantillons frais doivent être utilisés pour l'extraction de l'ARN, et les échantillons prélevés doivent être conservés dans de l'azote liquide ou un réfrigérateur à -80 ° C à temps, et la congélation et la décongélation répétées doivent être évitées.Des pointes sans RNase/DNase, des tubes à centrifuger et d'autres matériaux doivent être utilisés dans le processus d'extraction d'ARN.Le processus d'extraction doit être aussi rapide que possible.L'ARN extrait doit être placé sur une glacière et stocké à -80 dans le temps.Si l'ARN extrait doit être détecté par électrophorèse sur gel, l'électrophorèse doit être effectuée immédiatement après l'extraction et le tampon d'électrophorèse doit être remplacé par un tampon nouvellement préparé.
4. Résidus de sels et de solvants organiques
Les réactifs d'extraction contiennent des sels de phénol et de guanidine, et la solution de lavage contient de l'éthanol.Pendant le processus d'extraction, le lysat n'a pas été complètement absorbé et jeté, et la solution de lavage n'a pas été complètement séchée.Les sels résiduels et les solvants organiques sont nocifs pour la transcription inverse et la PCR ultérieures.Différents degrés d'inhibition, de sorte que le lysat tissulaire doit être entièrement éliminé pendant le processus d'extraction, et le lavage doit être suffisant pour que les parois environnantes du tube puissent être lavées.De plus, le tube est vidé et soufflé est une étape nécessaire, qui réduira encore le résidu de matière organique.
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Heure de publication : 01 décembre 2022
