La PCR directe est une réaction qui utilise directement des tissus animaux ou végétaux pour l'amplification sans extraction d'acide nucléique.À bien des égards, la PCR directe fonctionne comme la PCR ordinaire

La principale différence est le tampon personnalisé utilisé dans la PCR directe, l'échantillon peut être directement soumis à la réaction PCR sans extraction d'acide nucléique, mais il existe des exigences correspondantes pour la tolérance des enzymes et la compatibilité du tampon impliqué dans la réaction PCR directe.

Bien qu'il y ait plus ou moins d'inhibiteurs de PCR dans les échantillons courants, la PCR directe peut encore réaliser une amplification fiable sous l'action d'enzymes et de tampons.La réaction PCR traditionnelle nécessite un acide nucléique de haute qualité comme matrice, ce qui peut inhiber la progression régulière de la réaction PCR si la matrice contient des protéines et d'autres impuretés.La PCR directe est actuellement l'une des technologies les plus populaires dans le domaine du diagnostic moléculaire.

01 La PCR directe était à l'origine utilisée pour les animaux et les plantes

La première application de la PCR directe est dans le domaine des animaux et des plantes, tels que le sang, les tissus et les poils du rat, du chat, du poulet, du lapin, du mouton, du bétail, etc., les feuilles et les graines des plantes, etc., utilisé pour étudier le génotypage, transgénique, détection de plasmide, analyse d'inactivation de gène, identification de source d'ADN, identification d'espèce, analyse de SNP et d'autres domaines.

Ces champs ont certaines caractéristiques communes, c'est-à-dire que le contenu en gènes cibles est relativement élevé et que l'extraction des acides nucléiques est gênante, de sorte que la PCR directe peut non seulement gagner du temps et avoir un faible impact sur les résultats, mais également réduire les coûts.

La PCR directe utilisée pour la détection d'agents pathogènes est une affaire de ces dernières années, certains fabricants de réactifs PCR ont fait beaucoup d'efforts dans ce sens lors de l'innovation.En particulier dans cette épidémie de COVID-19, de nombreux produits de détection de ce type sont apparus sur le marché, tels que le kit de détection d'acide nucléique SARS-CoV-2 (méthode de sonde fluorescente PCR multiplex) étudié et développé par Foregene, qui utilise la technologie RT PCR en temps réel (rRT-PCR) pour la détection qualitative des acides nucléiques du SRAS-CoV-2 dans des échantillons d'écouvillons nasopharyngés ou oropharyngés humains.

Foregene est l'une des sociétés utilisant la technologie Direct PCR, pour la détection des ORF1ab normaux, N, E etune variante lignées d'acides nucléiques dans des échantillons d'écouvillons nasopharyngés ou oropharyngés humains tels que la lignée SARS-CoV-2 B.1.1.7 (UK), la lignée B.1.351 (ZA), la lignée B.1.617 (IND) et la lignée P.1 (BR).

02  Réactifs nécessaires pour la PCR directe

Échantillon Lysat

Le lysat d'échantillon peut être configuré par vous-même ou acheté.La différence dans la composition des différentes marques de lysat rendra la capacité de lyse différente, puis le temps de lyse sera légèrement différent.Par exemple, pour la préparation d'échantillons de tissus animaux, une lyse de 30 minutes ou d'une nuit est généralement recommandée, et la solution de lyse pour les virus varie de 3 à 10 minutes.

Mélange maître PCR

Il est recommandé d'utiliser l'ADN polymérase à démarrage à chaud pour améliorer l'amplification spécifique et augmenter la capacité d'amplification.Le cœur de la PCR directe est une polymérase hautement tolérante.

Éliminer ou inhiber les composants de l'échantillon qui affectent l'amplification de l'ADN

Une fois l'échantillon traité avec le lysat, des protéines, des lipides et d'autres débris cellulaires seront libérés, ces substances inhiberont la réaction PCR.Par conséquent, la PCR directe nécessite l'ajout d'une élimination ou d'inhibiteurs correspondants pour réduire l'influence de ces facteurs.

03  Une collection de cinq points de connaissance de la PCR directe

Premièrement, la technologie PCR directe est une technologie PCR directe pour divers échantillons biologiques.Dans cette condition technique, il n'est pas nécessaire de séparer et d'extraire l'acide nucléique, d'utiliser directement l'échantillon de tissu comme objet et d'ajouter les amorces du gène cible pour effectuer la réaction PCR.

Deuxièmement, la technologie PCR directe n'est pas seulement une technologie traditionnelle d'amplification de matrice d'ADN, mais comprend également la PCR de transcription inverse de matrice d'ARN.

Troisièmement, la technologie PCR directe effectue non seulement directement des réactions PCR qualitatives de routine sur des échantillons de tissus, mais inclut également des réactions qPCR en temps réel, ce qui nécessite que le système de réaction ait une forte capacité d'interférence de fluorescence anti-fond et que la fluorescence endogène neutralise la capacité antagoniste.

Quatrièmement, les échantillons ciblés par la technologie PCR directe n'ont besoin que de la libération de matrices d'acide nucléique et n'éliminent pas les protéines, les polysaccharides, les ions sels, etc. qui interfèrent avec la réaction PCR.Ce qui nécessite que la polymérase d'acide nucléique et le mélange PCR dans le système de réaction aient une excellente résistance et adaptabilité pour assurer l'activité enzymatique et la précision de la réplication dans des conditions complexes.

Cinquièmement, l'échantillon de tissu ciblé par la technologie Direct PCR sans aucun traitement d'enrichissement d'acide nucléique et la quantité de matrice est très faible, ce qui nécessite que le système de réaction ait une sensibilité et une efficacité d'amplification extrêmement élevées.