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Vérifier les performances des amorces et des sondes au stade précoce des réactifs de PCR et déterminer les conditions de réaction les plus appropriées sont les conditions préalables pour assurer le bon déroulement des expériences formelles.

Alors, comment devons-nous confirmer la sonde d'amorce à un stade précoce ?

Les principaux indicateurs sont la ligne de base, la courbe d'amplification, la valeur ct, l'efficacité d'amplification, la détection d'échantillons à faible concentration, le CV, etc.

Ligne de base

La ligne de base est la ligne horizontale dans la courbe d'amplification PCR.Dans les premiers cycles de la réaction d'amplification PCR, le signal de fluorescence ne change pas beaucoup et forme une ligne droite.Cette droite est la ligne de base.

Lors du dépistage des sondes d'amorce PCR, faites attention à ce que la ligne de base soit de niveau.La pureté de la concentration de la sonde d'amorce affectera la ligne de base, par exemple en provoquant une augmentation ou une diminution de la ligne de base.La ligne de base est également un indicateur très intuitif.
Analyse

Courbe d'amplification

Un autre indicateur intuitif est la forme de la courbe d'amplification.Il est préférable d'avoir une courbe en forme de S pour éviter une amplification secondaire ou d'autres courbes d'amplification anormales.
nul

Valeur CT

Le nombre de cycles correspondant au point d'inflexion de la ligne de base à la croissance exponentielle est la valeur Ct.

Pour le même échantillon, différentes sondes d'amorce entraînent différentes courbes d'amplification, et la valeur Ct correspondante sera affectée par l'efficacité d'amplification et le degré d'interférence.En théorie, plus la valeur Ct de la sonde d'amorce que nous choisissons est petite, mieux c'est.

Analyse-3

Efficacité d'amplification

L'une des méthodes les plus fiables et les plus stables pour évaluer l'efficacité de l'amplification par PCR est la courbe standard, qui est également largement reconnue par les chercheurs.Le procédé consiste à fabriquer une série d'échantillons pour contrôler le nombre relatif de modèles cibles.Ces échantillons sont généralement préparés par des dilutions en série de solutions mères concentrées, la plus couramment utilisée est la dilution au 10ème.À l'aide d'une série d'échantillons dilués, en utilisant le programme qPCR standard pour amplifier pour obtenir la valeur Cq, et enfin tracer une courbe standard en fonction de la concentration de chaque échantillon et de la valeur Cq correspondante pour obtenir l'équation linéaire Cq=-klgX0+b, et l'efficacité d'amplification E=10(-1/k)-1.Lors de l'utilisation de la qPCR pour l'analyse quantitative, l'efficacité d'amplification doit être comprise entre 90 % et 110 % (3,6 > k > 3,1).

Analyse-4

Détection d'échantillons à faible concentration

Lorsque la concentration de l'échantillon est faible, les taux de détection des différentes sondes d'amorce sont différents.Nous sélectionnons 20 échantillons à faible concentration à répliquer, et le système amorce-sonde avec le taux de détection le plus élevé est le meilleur.

Analyse-5

Coefficient de variation (CV)

10 échantillons en double peuvent être détectés avec différentes sondes d'amorce selon la ligne standard du réactif pour la détection d'amplification d'acide nucléique.

Analyse-6

Réactifs quantitatifs :
Précision
La précision au sein d'un lot doit être respectée : le coefficient de variation (CV, %) de la valeur logarithmique de la concentration d'essai est ≤ 5 %.Lorsque la concentration de l'échantillon est faible, le coefficient de variation (CV,%) du logarithme de la concentration de détection est ≤10%


Réactifs qualitatifs :
Précision
La précision au sein d'un lot doit respecter :

(1) Coefficient de variation de la valeur Ct (CV,%) ≤5%

Le même échantillon est testé en parallèle 10 fois et les résultats des tests doivent être cohérents


Heure de publication : 18 septembre 2021