Au stade précoce de l'épidémie, en raison du développement rapide, un diagnostic rapide des patients suspects est la clé de la prévention du COVID-19.Certains réactifs de détection d'acide nucléique approuvés ont un temps de développement court et il existe des problèmes tels qu'une confirmation de performance précipitée, une optimisation insuffisante des réactifs et de grandes différences entre les lots ;Les problèmes de divers laboratoires cliniques dans divers aspects du processus de détection d'acide nucléique peuvent également affecter la précision des résultats de détection d'acide nucléique.Cet article se concentrera sur les liens et les points clés de la détection actuelle des acides nucléiques du SRAS-CoV-2 et analysera les problèmes de réexamen faux négatif et positif de la détection des acides nucléiques en laboratoire et de l'incohérence clinique.

Principes de détection des acides nucléiques du SRAS-CoV-2

Le SRAS-CoV-2 est un virus à ARN avec une séquence génomique d'environ 29 kb, avec 10 gènes, qui peut coder efficacement 10 protéines.Les virus sont composés d'ARN et de protéines, et la couche la plus externe est un revêtement externe composé de lipides et de glycoprotéines.À l'intérieur, la capside protéique enveloppe l'ARN, protégeant ainsi l'ARN facilement dégradable (P1).

P1 Structure du SARS-COV-2

Les virus envahissent les cellules par le biais de récepteurs de surface cellulaire spécifiques pour provoquer une infection et utilisent les cellules hôtes pour se répliquer.

Le principe de la détection des acides nucléiques viraux consiste à exposer l'ARN viral à travers un lysat cellulaire, puis à utiliser la réaction en chaîne de polymérase-transcription inverse fluorescente en temps réel (RT-PCR) pour la détection.

La clé du principe de détection est d'utiliser des amorces et des sondes pour obtenir une « correspondance ciblée » des séquences d'acides nucléiques, c'est-à-dire pour trouver la séquence d'acide nucléique du SRAS-CoV-2 qui est différente des autres virus dans environ 30 000 bases (la similarité de l'acide nucléique avec d'autres virus) zone « basse »), concevoir des amorces et des sondes.

Les amorces et les sondes sont fortement appariées avec la région spécifique de l'acide nucléique SARS-CoV-2, c'est-à-dire que la spécificité est très forte.Une fois que le résultat de l'amplification RT-PCR fluorescente en temps réel de l'échantillon à tester est positif, cela prouve que le SARS-CoV-2 est présent dans l'échantillon.Voir P2.

P2 Étapes de détermination de l'acide nucléique du SARS-CoV-2 (RT-PCR fluorescente en temps réel)

Conditions et exigences du laboratoire pour la détection des acides nucléiques du SRAS-CoV-2

Les laboratoires d'essais d'acides nucléiques sont les plus idéaux pour les environnements à pression négative, et ils doivent prêter attention à la surveillance de la pression, maintenir la circulation de l'air et éliminer les aérosols.Le personnel chargé des tests d'acide nucléique doit posséder les qualifications correspondantes, recevoir une formation pertinente sur la réaction en chaîne par polymérase et réussir l'évaluation.Le laboratoire doit être strictement géré, zoné en place et le personnel non pertinent est strictement interdit d'entrer.La zone propre doit être ventilée et désinfectée sur place.Les articles pertinents sont placés dans des zones, propres et sales sont séparés, remplacés à temps et décontaminés sur place.Désinfection de routine : le désinfectant contenant du chlore est la principale solution pour les grandes surfaces, et l'alcool à 75 % peut être utilisé pour les petites surfaces.Une bonne façon de traiter les aérosols est d'ouvrir les fenêtres pour la ventilation, et la désinfection de l'air peut également être effectuée au moyen de rayons ultraviolets, de filtration et de désinfection de l'air.

Principaux liens et paramètres de la détermination des acides nucléiques du SARS-CoV-2 (RT-PCR fluorescente en temps réel)

Bien que les laboratoires accordent généralement une attention particulière à la "détection" des acides nucléiques, en fait, "l'extraction" des acides nucléiques est également l'une des étapes clés d'une détection réussie, qui est étroitement liée à la collecte et au stockage des échantillons de virus.

À l'heure actuelle, les échantillons respiratoires les plus largement utilisés, tels que les écouvillons nasopharyngés, utilisent la deuxième méthode, qui est une solution d'inactivation (conservation) préparée à base d'extraction d'acide nucléique et de solution de lyse.D'une part, cette solution de conservation du virus peut dénaturer la protéine du virus, perdre son activité et ne plus être infectieuse, et améliorer la sécurité de l'étape de transport et de détection ;d'autre part, il peut directement casser le virus pour libérer l'acide nucléique, éliminer l'enzyme de décomposition de l'acide nucléique et prévenir le virus.L'ARN est dégradé.

Une solution d'échantillonnage de virus préparée sur la base d'une solution de lyse d'extraction d'acide nucléique.Les principaux composants sont des sels équilibrés, un agent chélatant de l'acide éthylènediaminetétraacétique, un sel de guanidine (isothiocyanate de guanidine, chlorhydrate de guanidine, etc.), un tensioactif anionique (dodécane) sulfate de sodium), un tensioactif cationique (oxalate de tétradécyltriméthylammonium), du phénol, de la 8-hydroxyquinoléine, du dithiothréitol, de la protéinase K et plusieurs autres composants.À l'heure actuelle, il existe de nombreux types de kits d'extraction d'acide nucléique et différents réactifs d'extraction et de purification d'acide nucléique sont utilisés.Même si le même réactif d'extraction et de purification d'acide nucléique est utilisé, les procédures d'extraction de chaque kit sont différentes.

À l'heure actuelle, les produits du kit de détection d'acide nucléique approuvés par la National Medical Products Administration sont sélectionnés sur la base des gènes ORF1ab, E et N du génome du SRAS-CoV-2.Les principes de détection des différents produits sont fondamentalement les mêmes, mais leurs conceptions d'amorces et de sondes sont différentes.Il existe des segments à cible unique (ORF1ab), des segments à double cible (ORF1ab, N ou E) et des segments à trois cibles (ORF1ab, N et E).La différence entre la détection et l'interprétation, l'extraction d'acide nucléique et le système de réaction RT-PCR fluorescente en temps réel doit se référer aux instructions du kit concerné, et il est recommandé aux utilisateurs de suivre strictement la méthode d'interprétation spécifiée dans les instructions du kit pour l'interprétation.Les régions communes, les amorces et les séquences de sondes amplifiées par RT-PCR fluorescente en temps réel sont présentées en P3.

P3 L'emplacement de la cible de l'amplicon SARS-CoV-2 sur le génome et la séquence des amorces et des sondes

Interprétation des résultats de la détermination des acides nucléiques du SARS-CoV-2 (Real-Time RT-PCR fluorescente)

"Pneumonia Prevention and Control Plan for SARS-CoV-2 Infection (Second Edition)" a pour la première fois clarifié les critères pour juger les résultats de l'amplification d'un seul gène :

1. Aucun Ct ou Ct≥40 est négatif ;

2. Ct<37 est positif ;

3. La valeur Ct de 37 à 40 est la zone d'échelle de gris.Il est recommandé de répéter l'expérience.Si le résultat de refaire Ct<40 et que la courbe d'amplification présente des pics évidents, l'échantillon est jugé positif, sinon il est négatif.

La troisième édition du guide et la quatrième édition du guide ont poursuivi les critères ci-dessus.Cependant, en raison des différentes cibles utilisées dans les kits commerciaux, la 3e édition du guide susmentionnée n'a pas donné les critères pour déterminer la combinaison de cibles, en soulignant que les instructions fournies par le fabricant prévaudront.A partir de la cinquième édition des lignes directrices, deux cibles ont été clarifiées, notamment les critères de jugement pour une seule cible difficile à juger.Autrement dit, si le laboratoire veut confirmer qu'un cas est positif pour la détection de l'acide nucléique du SRAS-CoV-2, les conditions suivantes doivent être remplies 1 sur 2 :

(1) Deux cibles de SARS-CoV-2 (ORF1ab, N) dans le même échantillon sont testées positives par RT-PCR fluorescente en temps réel.Si une seule cible est positive, un nouvel échantillonnage et un nouveau test sont nécessaires.Si les résultats du test sont Si la cible unique est toujours positive, elle est jugée positive.

(2) Deux échantillons de RT-PCR fluorescente en temps réel ont montré une seule cible positive en même temps ou deux échantillons du même type ont montré un résultat de test positif à une seule cible, qui peut être jugé comme positif.Cependant, les lignes directrices soulignent également que les résultats négatifs des tests d'acide nucléique ne peuvent pas exclure l'infection par le SRAS-CoV-2.Les facteurs susceptibles de provoquer des faux négatifs doivent être exclus, notamment la mauvaise qualité des échantillons (échantillons respiratoires de l'oropharynx et d'autres parties), le prélèvement d'échantillons trop tôt ou trop tard, les échantillons n'ont pas été stockés, transportés et traités correctement, et la technologie elle-même a eu des problèmes (variation virale, inhibition de la PCR), etc.

Causes des faux négatifs dans la détection du SARS-CoV-2

Le concept de « faux négatif » dans les tests d'acide nucléique qui est actuellement concerné, fait souvent référence à des « faux négatifs » dans lesquels les résultats des tests d'acide nucléique sont incompatibles avec les manifestations cliniques, c'est-à-dire que les symptômes cliniques et les résultats d'imagerie sont fortement suspectés de COVID-19, mais les tests d'acide nucléique sont toujours « négatifs » plusieurs fois.Le Centre de laboratoire clinique de la Commission nationale de la santé a expliqué le test SARS-CoV-2 "faux négatif".

(1) Il y a une certaine quantité de virus dans les cellules de la personne infectée.Les données existantes montrent qu'après l'infection du corps par le virus, le virus pénètre dans la gorge par le nez et la bouche, puis dans la trachée et les bronches, puis atteint les alvéoles.La personne infectée connaîtra la période d'incubation, des symptômes légers, puis le processus de symptômes graves et les différents stades de la maladie.Et la quantité de virus présente dans différentes parties du corps est différente.

En termes de charge virale des types cellulaires, cellules épithéliales alvéolaires (voies respiratoires inférieures)> cellules épithéliales des voies respiratoires (voies respiratoires supérieures)> fibroblastes, cellules endothéliales, macrophages, etc. ;à partir du type d'échantillon, liquide de lavage alvéolaire (le plus excellent)> expectoration de toux profonde> écouvillon nasopharyngé> écouvillon oropharyngé> sang.De plus, le virus peut également être détecté dans les matières fécales.Cependant, compte tenu de la commodité de l'opération et de l'acceptation des patients, l'ordre d'échantillon clinique couramment utilisé est écouvillon oropharyngé> écouvillon nasopharyngé> liquide de lavage bronchique (opération complexe) et expectoration profonde (généralement toux sèche, difficile à obtenir) .

Par conséquent, la quantité de virus dans les cellules de l'oropharynx ou du nasopharynx de certains patients est faible ou extrêmement faible.Si seuls des échantillons de l'oropharynx ou du nasopharynx sont prélevés pour le test, l'acide nucléique viral ne sera pas détecté.

(2) Aucune cellule contenant le virus n'a été collectée lors du prélèvement de l'échantillon, ou l'acide nucléique viral n'a pas été efficacement conservé.

[① Site de collecte inapproprié, par exemple, lors de la collecte d'écouvillons oropharyngés, la profondeur de collecte n'est pas suffisante, les écouvillons nasopharyngés collectés ne sont pas collectés profondément dans la cavité nasale, etc. La plupart des cellules collectées peuvent être des cellules sans virus ;

②Les écouvillons d'échantillonnage ne sont pas utilisés correctement.Par exemple, les fibres synthétiques telles que la fibre PE, la fibre polyester et la fibre polypropylène sont recommandées pour le matériau de la tête de l'écouvillon.Des fibres naturelles telles que le coton sont utilisées en fonctionnement réel (forte adsorption de protéines et pas facile à laver) Et des fibres de nylon (mauvaise absorption d'eau, conduisant à un volume d'échantillonnage insuffisant) ;

③L'utilisation incorrecte des tubes de stockage de virus, telle que l'utilisation abusive de tubes de stockage en plastique polypropylène ou polyéthylène qui sont faciles à absorber les acides nucléiques (ADN/ARN), entraînant une diminution de la concentration d'acide nucléique dans la solution de stockage.En pratique, il est recommandé d'utiliser du plastique polymère polyéthylène-propylène et certains récipients en plastique polypropylène spécialement traités pour stocker les acides nucléiques viraux.]

[① Site de collecte inapproprié, par exemple, lors de la collecte d'écouvillons oropharyngés, la profondeur de collecte n'est pas suffisante, les écouvillons nasopharyngés collectés ne sont pas collectés profondément dans la cavité nasale, etc. La plupart des cellules collectées peuvent être des cellules sans virus ;

②Les écouvillons d'échantillonnage ne sont pas utilisés correctement.Par exemple, les fibres synthétiques telles que la fibre PE, la fibre polyester et la fibre polypropylène sont recommandées pour le matériau de la tête de l'écouvillon.Des fibres naturelles telles que le coton sont utilisées en fonctionnement réel (forte adsorption de protéines et pas facile à laver) Et des fibres de nylon (mauvaise absorption d'eau, conduisant à un volume d'échantillonnage insuffisant) ;

③L'utilisation incorrecte des tubes de stockage de virus, telle que l'utilisation abusive de tubes de stockage en plastique polypropylène ou polyéthylène qui sont faciles à absorber les acides nucléiques (ADN/ARN), entraînant une diminution de la concentration d'acide nucléique dans la solution de stockage.En pratique, il est recommandé d'utiliser du plastique polymère polyéthylène-propylène et certains récipients en plastique polypropylène spécialement traités pour stocker les acides nucléiques viraux.]

(4) Le fonctionnement du laboratoire clinique n'est pas standardisé.Les conditions de transport et de stockage des échantillons, le fonctionnement standardisé des laboratoires cliniques, l'interprétation des résultats et le contrôle de la qualité sont les facteurs clés pour garantir l'exactitude et la fiabilité des résultats des tests.Selon les résultats de l'évaluation externe de la qualité menée par le Centre de laboratoire clinique de la Commission nationale de la santé du 16 au 24 mars 2020, sur les 844 laboratoires ayant reçu des résultats valides, 701 (83,1 %) étaient qualifiés et 143 (16,9 %) ne l'étaient pas.Qualifiées, les conditions générales de test en laboratoire sont bonnes, mais différents laboratoires ont encore des différences dans la capacité de fonctionnement du personnel, la capacité d'interprétation des échantillons positifs à cible unique et le contrôle de la qualité.

Comment réduire le faux négatif de la détection des acides nucléiques du SARS-CoV-2 ?

La réduction des faux négatifs dans la détection des acides nucléiques doit être optimisée à partir des quatre aspects de la production de faux négatifs.

(1) Il y a une certaine quantité de virus dans les cellules de la personne infectée.La concentration du virus dans différentes parties du corps des personnes suspectées d'être infectées sera différente à différents moments.S'il n'y a pas de pharynx, il peut s'agir de liquide de lavage bronchique ou de matières fécales.Si plusieurs types d'échantillons peuvent être prélevés en même temps ou à différents stades de progression de la maladie pour les tests, cela aidera à éviter les faux négatifs.

(2) Les cellules contenant le virus doivent être collectées lors du prélèvement d'échantillons.Ce problème peut être résolu dans une large mesure en renforçant la formation des collecteurs d'échantillons.

(3) Réactifs IVD fiables.En effectuant des recherches sur l'évaluation des performances de détection des réactifs au niveau national et en discutant des problèmes existants, l'efficacité de détection des réactifs peut être encore améliorée et la sensibilité de l'analyse peut être améliorée.

(4) Fonctionnement normalisé des laboratoires cliniques.En renforçant la formation du personnel de laboratoire, en améliorant continuellement le système de gestion de la qualité du laboratoire, en assurant des divisions raisonnables et en améliorant la capacité de détection du personnel, il est possible de réduire les faux négatifs dus à des opérations de laboratoire inappropriées.

Raisons du nouveau test positif du test d'acide nucléique du SRAS-CoV-2 chez les patients récupérés et sortis

Le "COVID-19 Diagnostic and Treatment Plan (Trial Seventh Edition)" stipule clairement que l'un des critères pour que les patients COVID-19 soient guéris et sortent de l'hôpital est que deux échantillons consécutifs des voies respiratoires aient un test d'acide nucléique négatif (à au moins 24 heures d'intervalle), mais il y en a très peu. Le test d'acide nucléique du SRAS-CoV-2 était à nouveau positif chez les patients sortis pour diverses raisons.

(1) Le SRAS-CoV-2 est un nouveau virus.Il est nécessaire de mieux comprendre son mécanisme pathogène, l'image complète de la maladie causée et les caractéristiques de l'évolution de la maladie.Par conséquent, d'une part, il est nécessaire de renforcer la prise en charge des patients sortis et de procéder à une observation médicale de 14 jours.Effectuer un suivi, une surveillance de la santé et des conseils sanitaires pour approfondir la compréhension de l'ensemble du processus d'apparition, de développement et d'issue de la maladie.

(2) Le patient peut être à nouveau infecté par le virus.L'académicien Zhong Nanshan a déclaré : Parce que les patients guéris ont des anticorps, le SRAS-CoV-2 peut être éliminé par les anticorps lorsqu'ils envahissent à nouveau.Il existe de nombreuses raisons, qui peuvent être la cause du rétablissement du patient, ou être liées à la mutation du virus, ou même à la cause des tests de laboratoire.S'il s'agit du virus lui-même, la mutation du SRAS-CoV-2 peut rendre l'anticorps produit par le patient récupéré inefficace contre le virus muté.Si le patient est à nouveau infecté par le virus muté, le test d'acide nucléique peut être à nouveau positif.

(3)En ce qui concerne les méthodes d'essai en laboratoire, chaque méthode d'essai a ses limites.La détection de l'acide nucléique du SRAS-CoV-2 est due au choix de la séquence du gène, à la composition des réactifs, à la sensibilité de la méthode et à d'autres raisons, ce qui fait que les kits existants ont leurs propres limites de détection inférieures.Une fois le patient traité, le virus dans le corps diminue.Lorsque la charge virale de l'échantillon à tester est inférieure à la limite inférieure de détection, un résultat « négatif » apparaît.Cependant, ce résultat ne signifie pas que le virus dans le corps a complètement disparu.Le virus peut être après l'arrêt du traitement.Résurgence », continuer à copier.Par conséquent, il est recommandé de revoir une fois par semaine dans les 2 à 4 semaines après la sortie.

(4) L'acide nucléique est le matériel génétique du virus.Le virus est tué après que le patient a subi un traitement antiviral, mais les fragments d'ARN viral restants sont toujours retenus dans le corps humain et ne sont pas complètement évacués du corps.Parfois, dans certaines circonstances, il peut être plus retenu.Longtemps, et à ce moment le test d'acide nucléique sera « transitoirement » positif.Avec l'extension du temps de récupération du patient, après l'épuisement progressif des fragments d'ARN résiduels dans le corps, le résultat du test d'acide nucléique peut devenir négatif.

(5) Le résultat du test d'acide nucléique du SRAS-CoV-2 prouve uniquement la présence ou l'absence d'ARN viral, et ne peut pas prouver l'activité du virus et si le virus est transmissible.Il est nécessaire de prouver si un patient qui a à nouveau un test d'acide nucléique positif redeviendra une source d'infection.Il est nécessaire de réaliser une culture du virus sur des prélèvements cliniques et de cultiver un virus « vivant » pour prouver qu'il est infectieux.

Résumé

En résumé, les faux négatifs des tests d'acide nucléique du SRAS-CoV-2, les nouveaux tests positifs et d'autres conditions incompatibles avec les manifestations cliniques ne peuvent pas être complètement évités.Dans le dépistage et les tests réels, il est recommandé de combiner les symptômes cliniques, les examens d'imagerie (CT) et les expériences Résultats des tests de laboratoire (test d'acide nucléique + test d'anticorps spécifiques au virus) pour un diagnostic complet afin d'éviter un diagnostic manqué et un diagnostic erroné.Si les résultats du test s'avèrent manifestement incohérents avec les manifestations cliniques, il est recommandé de procéder à une analyse complète de l'ensemble du lien de test (collecte des échantillons, liens de circulation et de traitement) pour exclure une infection précoce par le virus SARS-CoV-2, une infection récurrente ou combinée avec d'autres infections virales respiratoires, etc. possible.Si les conditions le permettent, il est recommandé de prélever des échantillons plus sensibles tels que les crachats ou le liquide de lavage alvéolaire pour un réexamen.

Produits connexes:

Kit de détection d'acide nucléique SARS-CoV-2 (méthode de sonde fluorescente PCR multiplex)